高穎慧, 包 穎

(曲阜師范大學生命科學學院,273165,山東省曲阜市)

0 引 言

棉花(Gossypiumspp.)隸屬錦葵科(Malvaceae)、棉屬(GossypiumL.),是集多功能為一體的重要經濟作物.栽培棉花通常包括4個種：亞洲棉(G.arboretumL.)、草棉(G.herbaceumL.)、陸地棉(G.hirsutumL.)和海島棉(G.barbadenseL.).它們能夠提供天然纖維,在紡織業(yè)中占據(jù)舉足輕重的地位；其副產品經加工后,還可以開發(fā)出滿足人類消費需求的多種產品[1].然而,作為國民經濟發(fā)展的重要支柱,棉花產業(yè)一直受限于棉花欠佳的纖維品質、欠高的單位產量以及欠強的病蟲害防御能力等而發(fā)展遲緩.利用轉基因技術,快速培育高性能棉花品種,已經成為今后的發(fā)展方向.遺傳轉化胚性愈傷組織,是植物轉基因育種的主要途徑[2-3],但是,由于棉花的基因型多樣、植物木質化程度高、外植體敏感度差異大以及代謝物的成分與含量高等多種因素的影響,棉花與其他作物相比,組織培養(yǎng)非常困難[4].本文回顧并探討了影響棉花組織培養(yǎng)與植株再生的主要因素,分析了棉花組織培養(yǎng)中的常見問題,并對未來棉花快速組織擴繁的研究與發(fā)展予以展望.

1 影響棉花組織培養(yǎng)及植株再生的主要因素

棉花組織培養(yǎng)及植株再生受到一系列因素的影響,其中最重要的包括6個方面,即基因型、外植體類型、培養(yǎng)基組成、植物激素、光照和金屬離子等.

1.1 基因型

基因型是棉花組織培養(yǎng)工作中的重要限制因素,常涉及多個基因,遺傳調控過程復雜[4].在現(xiàn)已建立的棉花再生體系中,大多數(shù)品種含有珂字棉或岱字棉血統(tǒng)[5].珂字棉的胚胎發(fā)生能力非常強,但其農藝性狀并不適合現(xiàn)代農業(yè)的發(fā)展,所以珂字棉常常被用作研究棉花遺傳特征、生理指標、細胞學分析等工作的模式品種[6].

早期的研究表明,基因型的差異對棉花愈傷組織的誘導影響不大.例如,有研究顯示[7],利用不同培養(yǎng)基對62個棉花品種下胚軸進行誘導,30天后均能誘導出愈傷組織.然而,該研究也發(fā)現(xiàn),不同基因型在不同培養(yǎng)基上產出的愈傷、形態(tài)、顏色都出現(xiàn)了很大的差異.其中具有強胚胎發(fā)生能力的品種,會形成質地均勻、疏松且呈現(xiàn)淡黃色或黃綠色的愈傷組織；而具有弱胚胎發(fā)生能力的品種,則會產生質地緊密、堅硬且呈現(xiàn)白或綠色的塊狀愈傷組織.

在體細胞胚胎發(fā)生能力方面,棉花不同基因型間存在著較大的差異.多位研究者對不同基因型棉花的胚胎發(fā)生能力進行比較時發(fā)現(xiàn),無論是物種間還是物內品種間,棉花體胚發(fā)生的能力均表現(xiàn)出不同的特點(表1)[8-12].

表1 棉花胚胎再生能力的分類

吳家和等[13]發(fā)現(xiàn),不同基因型種子的再生能力是制約體胚再生率和轉化率的主要因素.目前對棉花進行的分子育種與遺傳改良的工作,在很大程度上依賴于體細胞植株再生過程.所以,選育出再生能力強、農藝性狀優(yōu)的基因型,將成為研究者們今后努力的方向.

1.2 外植體類型

體細胞培養(yǎng)是棉花組培中最常用的方式.建立該體系的關鍵因素之一便是外植體的選擇.不同的外植體,如胚珠、胚軸、葉片、葉柄、根、子葉、莖尖等,其出愈率、胚性愈傷轉化率都存在著較大的差別.關于誘導棉花愈傷組織的例子最早來自Baesley的報道[14].該學者發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基上的胚珠,可以從珠孔處形成愈傷組織.但遺憾的是,這些愈傷組織在繼代培養(yǎng)后生長效果變差,沒有進行下去.之后,有學者利用陸地棉Coker 310的子葉誘導愈傷組織并最終獲得了再生植株[15].接下來,隨著棉花組培工作的陸續(xù)開展[16-18],研究者們發(fā)現(xiàn),在諸多的外植體中,下胚軸的誘導能力最強,子葉次之；但是當適當控制不同的激素使用和配合其他條件,其他外植體的誘導效率也會升高[16-18].例如：劉桂云通過對激素與溫光條件的調控,獲得了以戴維遜氏棉葉片為外植體的典型胚狀體[17].張朝軍等通過調配生長激素,成功利用棉花(CCRI 24)葉柄進行了初生愈傷組織的誘導[18].

1.3 培養(yǎng)基組成

長期以來,瓊脂(Agar)一直是棉花組織培養(yǎng)研究中最常用的凝固劑.但是,Thomas等[19]研究表明,吉蘭糖膠(Gelrite)可以在一定程度上替代瓊脂,并產生更多的愈傷組織.鄭泗軍等發(fā)現(xiàn),當使用吉蘭糖膠作凝固劑時,棉花(河南79)胚性愈傷組織的比例大幅度增加[20].隨后的研究發(fā)現(xiàn)[21],植物凝膠具有含雜質少、透氣性高、透明度好、凝固點低,以及不需要二價陽離子等特性,因此較其他凝固劑更具優(yōu)勢；相對于瓊脂、吉蘭糖膠,在植物凝膠(Phytagel)作為固化劑的培養(yǎng)基上,陸地棉體胚萌發(fā)率與再生率、再生植株的正常出苗率均得到顯著提高[21].

除了凝固劑,組織基中還需要添加一些必要的營養(yǎng)、激素、離子等物質.培養(yǎng)基組成在誘導的不同階段、不同基因型的相同階段,均存在較大差異(表2),因此是影響棉花組織培養(yǎng)的重要外部因素.通常情況下,在棉花組織培養(yǎng)中,MS培養(yǎng)基是基礎培養(yǎng)基,其他各類培養(yǎng)基多是在此培養(yǎng)基的基礎上改良或擴展而來.

表2 不同品種棉花再生體系中的培養(yǎng)基組分

1.4 植物激素

在棉花組培與植株再生過程中,植物激素的種類與濃度是重要的調控因素,也是最復雜的因素,與植物的胚胎發(fā)生存在著密切的聯(lián)系.植物常見的內源激素包括吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic Acid,IAA)、激動素(Kinetin,KT)、脫落酸(Abscisic acid,ABA)、赤霉素(Gibberellin,GA)和乙烯(Ethylene,ETH)等.此外,人們在生產實踐中,還合成了諸多植物生長調節(jié)劑,如2,4-D-二氯苯氧乙酸鈉(2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4-D).這些激素在特定棉花品種的組織培養(yǎng)中,均能起到不同程度的促進作用(表2).

2,4-D是人工合成的生長素類似物,常被作為植物生長調節(jié)劑,用于植物組織培養(yǎng)[26-30].不同生長素類物質對照使用試驗表明,2,4-D對于促進外植體形成愈傷組織的作用效果最為明顯[26].Price和Smith[26]也證明,2,4-D是外植體脫分化和提高出愈率的最有效的植物生長調節(jié)劑.同時,在胚狀體發(fā)育和成熟階段,低濃度的2,4-D可以提升胚狀體的誘導率[27].但是有研究證明,較長時間的2,4-D處理,會明顯抑制胚性愈傷組織中的體細胞胚發(fā)生受體激酶基因GhSERK2的轉錄水平,并通過影響內源激素平衡,對胚性愈傷組織的生長產生不利影響[28].在棉花組織培養(yǎng)中,2,4-D多與其他激素配合使用,很少單獨使用[29,30].

ABA,因能促進葉脫落而得名.在棉花組織培養(yǎng)中,ABA能調控體胚的發(fā)生.有研究表明,ABA可以通過誘導LEC1(LEAFYCOTYLEDON1)、LEC2(LEAFYCOTYLEDON2)、FUS3(FUSARIUM3)和WUSCHEL等基因的表達,調控ABA和GA的動態(tài)平衡,促進棉花(CCRI 24)體胚的產生及成熟[31].

反式-玉米素(trans-Zeatin,ZT)是一種從玉米中分離出來的天然激素,作用效果類似于KT,能夠促進細胞分裂.單獨使用ZT即可直接誘導獲得棉花(CCRI 12)胚狀體[32].在ZT與其他激素的互作方面[32],IAA的添加能夠削弱ZT的誘導效果；2,4-D的添加雖然有利于愈傷組織的形成,卻不利于直接誘導出胚性愈傷組織.

除以上這些研究較多的激素外,其他激素有時也被引入棉花的組織培養(yǎng)之中(表2).如蕓苔素內酯(Brassinolide,BR),它是一種天然的甾體化合物,可以作為廣譜的植物生長調節(jié)劑.有研究者發(fā)現(xiàn)僅使用0.01 ppm的BR,就能從陸地棉Coker 201和Coker 312兩個品種的外植體中獲得有效保持活力和胚性的愈傷組織[30].

由此可見,激素或添加物的種類與濃度、外植體的選擇等,均會對不同品種棉花的組織培養(yǎng)產生重要影響(表3).

表3 激素或添加物對棉花組培的作用效果

1.5 光照

光照是植物生長過程中的主要能量來源,同時又是一個復雜的環(huán)境因素.在植物組織培養(yǎng)中,光照對培養(yǎng)材料的增殖與分化有著重要的影響.

光周期途徑,是植物生態(tài)學中研究的較為深入的植物開花調控途徑[35].在植物組織培養(yǎng)中,合適的光周期能夠使外植體材料保持良好的生理狀態(tài),從而影響愈傷組織的形成、胚性愈傷轉化等過程[36,37].

光質是棉花組織培養(yǎng)中的重要物理因素,不同波長的光能夠激活植物相應的信號傳導通路,使植物通過光質感受外界變化,進而調節(jié)自身的生長發(fā)育[38].單色光可調節(jié)植物次生代謝產物的含量,從而提高植物的存活率[39].

在一般的棉花組培工作中,白光的應用最普遍.而近期研究發(fā)現(xiàn)[40],紅光條件處理的外植體,分化時間更短,產生的愈傷組織質量更高,表現(xiàn)為：黃褐色、體積適中,鮮重更高.究其原因,可能與棉花體胚基因AGL15、LEC2、WUS在紅光條件下表達量上調促進愈傷組織產生胚性有關[41].另外,紅光可以促進植物生長素的合成及其轉運,一定強度的紅光有益于內源生長素的合成,進而有利于植物的生長發(fā)育[41-43].研究者通過進一步的嘗試與探究,發(fā)現(xiàn),在棉花(CCRI 12、CCRI 24)組培中,可以綜合使用白光和紅光,即先利用白光誘導初級體細胞胚,然后再利用紅光誘導胚性愈傷組織[44].

藍光可以影響植物的向光性、促進下胚軸伸長、調節(jié)氣孔開放、催化相關酶的合成與控制葉綠體運動等,是影響植物發(fā)育與生長的另一重要光質[45,46].然而單純地使用某種單色光并不能滿足植物生長發(fā)育的要求[47].在棉花組培方面,以CCRI 12下胚軸為外植體,魏喜等通過探究不同紅藍配比的光質對棉花組培的影響,最終發(fā)現(xiàn)藍∶紅=1∶3的光質組合利于胚狀體的誘導[48].

1.6 金屬離子

在植物的組織培養(yǎng)中,除選擇適宜的植物激素外,合理地調配金屬離子的種類與濃度,也是促進植物愈傷組織形成、減少褐變與促進植株再生的重要方法.

在棉花(細胞質雄性不育的恢復系 G007)的組織培養(yǎng)中,適宜濃度的Zn2+、Ni2+和Ag+能提高出愈速度,對植株再生過程起到積極作用,而加入Co2+后,作用效果與此相反[49].然而,單獨使用某種金屬離子往往不能滿足植物快繁的需要.有研究者發(fā)現(xiàn)5 μmol/L的Zn2+和5 μmol/L的 Ni2+的組合不僅能抑制棉花外植體的褐變,而且能正向協(xié)調愈傷誘導和胚胎發(fā)生[49].

2 棉花組織培養(yǎng)中存在的問題及展望

2.1 存在的問題、可能的成因和解決方法

在棉花組織培養(yǎng)過程中,常見的問題主要為污染、畸形胚和褐變.污染在植物組織培養(yǎng)中屬于常規(guī)問題,一般情況下,只要做到外植體、培養(yǎng)基、操作環(huán)境與培養(yǎng)環(huán)境嚴格無菌,該問題不難解決.因此,相對而言,對于棉花再生體系的構建,最棘手的是畸型胚的出現(xiàn)和褐變問題.

畸形胚出現(xiàn)的原因,一段時間內是學者們探討的熱點.有學者發(fā)現(xiàn),在胚性愈傷組織細胞中,存在著大量的染色體數(shù)目和結構的變異,因此認為染色體變異是畸形胚的主要成因之一[50].還有研究證實,隨著培養(yǎng)時間的延長,愈傷組織的變異頻率有上升趨勢,變異類型也更加豐富[51].因此,過長的繼代培養(yǎng)時間,也可能是造成畸形出現(xiàn)的重要原因.目前,通過調整外源激素或添加物的種類和濃度,如增加蔗糖(Sucrose)濃度、添加聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)以及選取適當種類和濃度的凝固劑等措施,已經能夠在一定程度上抑制畸形胚的發(fā)生[52].

棉花愈傷組織的褐變問題是制約其再生體系建立的另一難題.褐變現(xiàn)象往往受外界培養(yǎng)條件與植物本身遺傳特性的共同影響.師海榮等通過實驗比較分析了3個陸地棉品種(713、百棉1號、百棉3號)的褐變愈傷組織中多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase) 的活性和棉酚(Gossypol)含量,發(fā)現(xiàn)它們均高于正常的愈傷組織[53],這也印證了在植物生理學上,被大家熟知的有關多酚氧化酶與酚類物質在有氧條件下被氧化為醌類物質,抑制了多種酶的活性,從而影響了愈傷組織的正常生長,甚至導致其死亡的觀點[54].有學者利用活性炭(Activated Carbon)的吸附性,吸收組培環(huán)境中對植物細胞不利的酚類化合物和過量添加物[55],達到了抑制褐變現(xiàn)象的效果.同時,改變碳源也是應對褐變現(xiàn)象的新思路.如Sunnichan 等[56]使用甘露糖(Aldohexos)作為培養(yǎng)基中的唯一碳源,在從Coker 310外植體誘導為愈傷組織到體胚發(fā)生的整個階段中,都沒有出現(xiàn)組織褐變現(xiàn)象.

2.2 展望

隨著越來越多作物全基因組測序的完成、諸多基因改造技術如Crispr等的不斷完善,作物分子育種和基因革新已經成為新時代農業(yè)發(fā)展的必然趨勢.在此背景下,如何合理地將植物組織培養(yǎng)和分子改良有機結合,將是今后檢測基因功能、評價作物性狀和構建快繁體系的關鍵.但是,棉花的組織培養(yǎng)一直是公認的技術難題,盡管陸續(xù)有不同的學者在特定的棉花品種上成功培育出了再生體系,但是這些再生體系往往缺少通用性和推廣性.此外,以往的研究在有效誘導胚性愈傷、控制畸形胚和褐化現(xiàn)象以及縮短組培周期等方面,還缺少明顯的突破,這種現(xiàn)狀嚴重限制了棉花遺傳育種的長足發(fā)展.因此,進一步闡明外界物理因素與棉花生理功能之間的關系,縮短繼代周期、快速提升體胚誘導和植株再生,同時有效控制畸形胚和褐變現(xiàn)象,兼顧不同品種棉花的遺傳差異,尋找更為高效、廣譜的棉花再生體系,將成為今后研究與發(fā)展棉花組織培養(yǎng)的主要方向.