熊欣，郭艷芳，鐘振華，夏紅英，劉貞，程奇珍

江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

注射用鹽酸吉西他濱為處方藥，國家基本藥物目錄品種。由美國禮來公司研發(fā)，商品名為Gemzar，1995年在英國上市，1999年進(jìn)口我國。鹽酸吉西他濱為二氟核苷抗代謝類藥，被美國FDA批準(zhǔn)為非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、胰腺癌以及乳腺癌的一線化療藥［1-5］。主要引起骨髓抑制，胃腸反應(yīng)、肝腎損害、輕度蛋白尿和血尿、皮膚毒性等不良反應(yīng)［6-7］。

參照企業(yè)提供的合成工藝，結(jié)合相關(guān)研究資料［8-12］，本實(shí)驗(yàn)建立了氣相色譜法測定注射用鹽酸吉西他濱中3種有機(jī)溶劑殘留量，并對(duì)收集到的樣品及其原輔料中丙酮、二氯甲烷、吡啶進(jìn)行檢測。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent Agilent 7693型氣相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；MS105 型電子天平（精密度：十萬分之一，METTLER TOLEDO）；ML204型電子天平（精密度：萬分之一，METTLER TOLEDO）。

1.2 試藥

鹽酸吉西他濱（4家生產(chǎn)企業(yè)，8批次）；注射用鹽酸吉西他濱（8家生產(chǎn)企業(yè)，58批次）；丙酮［色譜純，永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司，批號(hào)：20150505，含量≥99.0%］；二氯甲烷（色譜純，禹王集團(tuán)，批號(hào): 2015032501，含量≥ 99.0%）；吡啶（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：190109 2）；N,N-二甲基甲酰胺（色譜純，Anaqua Chemical supply，批號(hào)：38Y1805HY）。

2 方法與結(jié)果

2.1 注射用鹽酸吉西他濱中丙酮、二氯甲烷與吡啶殘留量的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：DB-5毛細(xì)管柱（30 m×0.53μm ×5 μm），序列號(hào)：125-5035；載氣：氮?dú)?；程序升溫：起始溫度?0 ℃，維持10 min，以每分鐘20 ℃的速率升溫至160 ℃維持5 min，再以每分鐘40 ℃的速率升溫至200 ℃，維持15 min；進(jìn)樣口溫度：200 ℃；檢測器溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：直接進(jìn)樣；進(jìn)樣量：5 μL；氮?dú)饬魉伲? mL/min；分流比3∶1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取丙酮、二氯甲烷與吡啶適量，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并定量稀釋制成含每1 mL含丙酮0.5 mg、二氯甲烷60 μg與吡啶0.2 mg的混合溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品3瓶內(nèi)容物，混合均勻，稱取適量（約含鹽酸吉西他濱0.5 g），置5 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液進(jìn)樣，各成分峰之間的分離度均應(yīng)符合要求。出峰順序依次為丙酮、二氯甲烷、吡啶，各峰之間的分離度均符合要求，系統(tǒng)適用性良好。

2.1.5 專屬性試驗(yàn) 精密量取N，N-二甲基酰胺5 μL直接進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶劑對(duì)3種溶劑的測定無干擾。

2.1.6 線性 精密稱取二氯甲烷0.122 0 g，置50 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25 mL，置100 mL量瓶中，精密稱取丙酮0.505 5 g、吡啶0.214 0 g，置同一100 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。

精密量取混合對(duì)照品貯備液0.5、1.0、1.0、1.0、2.0、4.0 mL，分別置50、50、20、10、10、10 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為混合線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液①②③④⑤⑥。按“2.1.1”色譜條件測定。以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，丙酮濃度在0.050 55～2.022 00 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；二氯甲烷濃度在0.006 1～0.244 0 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好；吡啶濃度在0.021 4～0.856 0mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。結(jié)果詳見表1。

表1 丙酮、二氯甲烷與吡啶線性方程表

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液④，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，記錄峰面積，計(jì)算峰面積RSD值。結(jié)果表明，丙酮、二氯甲烷與吡啶峰面積RSD值分別為0.4%、0.8%與1.1%，儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為160904樣品約0.95 g，精密稱定，重復(fù)取樣6次，分別置5 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，直接進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算檢出殘留溶劑的量。結(jié)果表明，該樣品檢出丙酮，平均殘留量為0.004 1%（n=6），平行性良好。

2.1.9 回收率試驗(yàn) 精密量取線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液①5mL，置25 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為回收率溶液①；分別精密量取混合對(duì)照品貯備液2、3 mL，分別置20、25 mL量瓶中，作為回收率溶液②③。

取本品內(nèi)容物約0.47 g 9份，精密稱定，置5 mL量瓶中，第1～3號(hào)樣品分別加回收率溶液①溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；第4～6號(hào)樣品分別加回收率溶液②溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；第7～9號(hào)樣品分別加回收率溶液③溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，直接進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，丙酮、二氯甲烷與吡啶的平均回收率分別為96.7%、93.6%、90.5%（n=9），符合藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則［8］中的回收率范圍要求（85%～110%）。

2.1.10 最低檢測限 精密量取線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液①1 mL，置100 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，直接進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖，二氯甲烷峰、吡啶峰信噪比約為3∶1。

精密量取線性系列標(biāo)準(zhǔn)溶液①5 mL，置10 mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，直接進(jìn)樣5 μL，記錄色譜圖，丙酮峰信噪比約為3∶1。結(jié)果詳見表2。

表2 最低檢測限結(jié)果表

2.2 注射用鹽酸吉西他濱測定結(jié)果

采用擬定方法對(duì)來源于8家生產(chǎn)企業(yè)的58批次注射用鹽酸吉西他濱抽驗(yàn)樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，58批次樣品均未檢出吡啶與二氯甲烷；有51批次檢出丙酮，檢出率為87.9%，平均檢出量（以鹽酸吉西他濱計(jì)）為0.048%，結(jié)果均符合藥典要求。測定結(jié)果詳見表3。

表3 各企業(yè)樣品中丙酮檢出量情況統(tǒng)計(jì)表

本次抽驗(yàn)樣品有同企業(yè)同批號(hào)樣品共9批次，結(jié)果表明，A企業(yè)批號(hào)為190102的3批次樣品中丙酮?dú)埩袅看嬖诓煌潭鹊呐g差異，其中2批殘留量約為另1批殘留量的7倍，但檢出量均較小。因制劑生產(chǎn)過程中不使用丙酮，結(jié)果的差異可能與原料生產(chǎn)過程中是否混勻或制劑的貯藏條件有關(guān)；其余同批號(hào)樣品間丙酮?dú)埩袅康牟町惒淮蟆＝Y(jié)果詳見表4。

表4 各企業(yè)同批號(hào)樣品丙酮檢出量統(tǒng)計(jì)表

2.3 注射用鹽酸吉西他濱原料測定結(jié)果

本次抽驗(yàn)共收集到8批次原料藥，涉及原料藥生產(chǎn)企業(yè)4家。根據(jù)4家企業(yè)提供的原料藥合成工藝，不同企業(yè)使用的起始物料、合成路線及提純工藝均不同，工藝中涉及使用的有機(jī)溶劑種類也有不同，同時(shí)原料藥企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)中的殘留溶劑檢查項(xiàng)對(duì)殘留溶劑的檢測方法以及檢測溶劑種類也存在較大差異。

對(duì)該8批次原料藥采用“2.1.1”色譜條件測定其殘留溶劑，結(jié)果顯示，8批次原料藥中均未檢出二氯甲烷與吡啶，僅來源于a企業(yè)的3批次原料藥（批號(hào)不同）中檢出丙酮，且該3批次原料分別由3家不同制劑企業(yè)提供，其含量分別為0.004 8%、0.009 6%、0.009 9%，平均含量為0.008 1%，均低于藥典規(guī)定限度。結(jié)果詳見表5。

表5 鹽酸吉西他濱原料中丙酮測定結(jié)果

原料藥中主要檢出丙酮，是源于吉西他濱在成鹽工藝中使用了甲醇溶劑，成鹽后用丙酮重結(jié)晶并洗滌。而制劑中檢出了丙酮，提示制劑中的溶劑殘留主要來源于原料藥。

2.4 注射用鹽酸吉西他濱輔料測定結(jié)果

通過發(fā)函調(diào)研，共收集到注射用鹽酸吉西他濱國內(nèi)9家生產(chǎn)企業(yè)的處方信息。所有企業(yè)的處方使用的藥用輔料均為甘露醇（賦形劑）、醋酸鈉（pH緩沖劑）與注射用水（溶劑，最終除去），pH調(diào)節(jié)劑為鹽酸、氫氧化鈉或醋酸鈉，部分企業(yè)還使用了活性炭進(jìn)行脫色、除熱原等。 此次抽檢樣品涉及的8家企業(yè)處方與原研處方的原輔料成分一致，但是1家企業(yè)（A）的甘露醇處方量與原研不同；2家企業(yè)（F、G）的醋酸鈉處方量與原研不同，并使用醋酸鈉調(diào)節(jié)藥液的pH值至規(guī)定范圍。對(duì)8家企業(yè)提供的26批輔料進(jìn)行了檢測，結(jié)果三種殘留溶劑均未檢出。制劑企業(yè)提供的甘露醇、醋酸鈉及活性炭輔料中，均未檢出丙酮、二氯甲烷與吡啶。

3 結(jié)果與討論

通過比較制劑使用的原料來源及批號(hào)發(fā)現(xiàn)，（1）同一批次制劑中未測定出丙酮，而其使用的2批次原料中僅1批測出丙酮；（2）同一制劑企業(yè)所有樣品均有丙酮檢出，而其提供的原料未檢出丙酮；（3）同一制劑企業(yè)樣品中有部分批次有丙酮檢出，而其提供的3批原料均未檢出丙酮；（4）同一制劑企業(yè)樣品中有部分批次有丙酮檢出，而其提供原料檢出丙酮；（5）不同制劑企業(yè)采用同一原料企業(yè)提供的原料生產(chǎn)，原料中未檢出丙酮，而制劑存在部分批次有丙酮檢出、部分批次未檢出的現(xiàn)象。產(chǎn)生以上現(xiàn)象的原因，可能與制劑使用的原料與本試驗(yàn)檢測的原料批號(hào)不同，而原料丙酮?dú)埩袅看嬖谂g差異有關(guān)。制劑中的丙酮?dú)埩袅靠赡転樵蠋?，且可能存在制劑生產(chǎn)過程或貯藏過程中造成丙酮的揮發(fā)或分解的現(xiàn)象。

因二氯甲烷與吡啶限度較低，頂空進(jìn)樣方法靈敏度欠佳，故選擇直接進(jìn)樣法對(duì)丙酮、二氯甲烷與吡啶進(jìn)行檢測［13-14］。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本試驗(yàn)建立的定量檢測注射用鹽酸吉西他濱中3種有機(jī)溶劑的氣相色譜法，操作簡便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性好，可用于注射用鹽酸吉西他濱中該3種溶劑殘留量的日常檢測，為制劑及原料藥中殘留溶劑的合理控制及其法定標(biāo)準(zhǔn)是否增訂殘留溶劑檢查項(xiàng)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。結(jié)合原料及制劑測定結(jié)果，建議原料與制劑生產(chǎn)企業(yè)優(yōu)化生產(chǎn)工藝，嚴(yán)格控制內(nèi)部工藝的穩(wěn)定性，提高批間批內(nèi)精密度。