李敏，李忠信，楊會(huì)舉#

1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肛腸科，鄭州450000

2 漯河市臨潁縣第二人民醫(yī)院肛腸科，河南 漯河4620000

結(jié)直腸癌是中國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素的過(guò)程，目前尚不清楚其發(fā)病機(jī)制。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄體長(zhǎng)度大于200 nt 的RNA，不編碼任何蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在細(xì)胞周期調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，尤其是在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中。LINC00261 是一個(gè)位于20p11.21 上的基因間lncRNA，LINC00261在多種腫瘤中起著促癌基因的作用。Fan 等發(fā)現(xiàn)LINC00261 在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，并能上調(diào)Slug 蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程。抑制LINC00261 表達(dá)可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，并增加對(duì)化療藥物順鉑的敏感性。然而，目前尚不清楚LINC00261在結(jié)直腸癌中的作用，因此本研究擬探討lncRNA LINC00261 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017 年7 月至2020 年7 月于河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院接受手術(shù)切除術(shù)的86 例結(jié)直腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理組織學(xué)診斷為結(jié)直腸癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②術(shù)前已接受過(guò)放療、化療等其他治療干預(yù)。86 例結(jié)直腸癌患者中，男47 例，女39 例；年齡35～75 歲，平均（58.26±11.63）歲；根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，低分化31 例，中分化42 例，高分化13 例；美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM 分期：Ⅰ期18 例，Ⅱ期44例，Ⅲ期24 例。收集86 例結(jié)直腸癌患者術(shù)中留取的結(jié)直腸癌組織及癌旁組織石蠟標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 原位雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中LINC00261 的表達(dá)

按照原位雜交試劑盒（購(gòu)自武漢博斯特有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水合，用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水沖洗3 次，每次5 分鐘，然后在室溫下用3%過(guò)氧化氫處理10 分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用DEPC 水沖洗3 次，逐滴添加30 μl 用3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶，37 ℃孵育20 分鐘，DEPC 水沖洗3次，1%多聚甲醛室溫下固定10 分鐘，DEPC 水沖洗3 次，然后將20 μl 預(yù)雜交溶液逐滴添加到每個(gè)切片中，并在37 ℃孵箱中進(jìn)行預(yù)雜交，2～4 小時(shí)后添加20 μl 探針雜交溶液（購(gòu)自武漢博斯特有限公司），37 ℃孵育過(guò)夜。次日，使用由高到低濃度的檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，除去多余的探針，然后向切片中滴加50μl 封閉液，在37 ℃環(huán)境下封閉30 分鐘，然后逐滴添加50μl 生物素化的小鼠抗人地高辛抗體，并在37 ℃環(huán)境下孵育120 分鐘，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗3次，每次5 分鐘，滴加50 μl 鏈球菌親和素-生物素復(fù)合物，在37 ℃環(huán)境下孵育30 分鐘，PBS 沖洗3次，逐滴添加生物素化過(guò)氧化物酶50 μl，在37 ℃環(huán)境下孵育30 分鐘，PBS 沖洗3 次，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色5 分鐘，蘇木素復(fù)染，干燥透明后，用中性樹(shù)脂封片。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

以探針雜交溶液替換為無(wú)探針雜交前溶液作為陰性對(duì)照，隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野（×400），采用免疫組織化學(xué)染色，根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞無(wú)染色，計(jì)0 分；細(xì)胞呈淺棕色，計(jì)1 分；細(xì)胞呈棕色、無(wú)背景色或細(xì)胞呈深褐色、背景為淺棕色，計(jì)2 分；細(xì)胞呈深褐色，無(wú)背景色，計(jì)3 分。按陽(yáng)性細(xì)胞占比計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)0 分；陽(yáng)性細(xì)胞占比≤25%，計(jì)1 分；25%﹤陽(yáng)性細(xì)胞占比﹤50%，計(jì)2 分；陽(yáng)性細(xì)胞占比≥50%，計(jì)3 分。二者之積為最終得分，即0～1 分為陰性，2～3 分為弱陽(yáng)性，4～7 分為陽(yáng)性，≥8 分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LINC00261 在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

LINC00261 在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為62.79%（54/86），明顯高于癌旁組織的8.14%（7/86），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

χ

=53.751，

P

﹤0.01）。（圖1）

圖1 原位雜交技術(shù)檢測(cè)LINC00261在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況（HE染色，×400）

2.2 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中LINC00261 表達(dá)情況的比較

不同分化程度、TNM 分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中LINC00261 陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05）；不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑的結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中LINC00261 陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹥0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中LINC00261 表達(dá)情況的比較（n=86）

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率都很高，而且近年來(lái)呈年輕化趨勢(shì)增長(zhǎng)。早期結(jié)直腸癌手術(shù)加放化療治愈率高，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌仍然很難治愈，因此，迫切需要新的早期診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物。

lncRNA 與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，越來(lái)越多的證據(jù)表明，失調(diào)的lncRNA 與腫瘤的發(fā)病、復(fù)發(fā)和預(yù)后不良有關(guān)，可作為腫瘤早期診斷的新型生物標(biāo)志物。LINC00261 是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)的lncRNA。在乳腺癌細(xì)胞中，沉默LINC00261 可顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)G/G期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、MMP9、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）表達(dá)，增強(qiáng)上皮鈣黏素（E-cadherin）表達(dá)。在人胰腺癌和人肺癌細(xì)胞系中，抑制LINC00261 表達(dá)可抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力。上述研究表明，LINC00261 影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而，目前尚不清楚LINC00261 在結(jié)直腸癌中的作用。

本研究應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)lncRNA LINC00261 的表達(dá)，原位雜交是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞中的待測(cè)核酸雜交，再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測(cè)系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，其具有較高的靈敏度和特異度，可作為半定量檢測(cè)方法。本研究結(jié)果顯示，LINC00261在結(jié)直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為62.79%（54/86），明顯高于癌旁組織的8.14%（7/86），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）。表明LINC00261在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，這可能是由于高表達(dá)的LINC00261 抑制相關(guān)蛋白的合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)功能的改變，最終使細(xì)胞發(fā)生癌變。本研究進(jìn)一步分析了不同臨床特征結(jié)直腸癌患者癌組織中LINC00261 表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同分化程度、不同TNM 分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者癌組織中LINC00261 的陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05），即分化程度越低、TNM 分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則結(jié)直腸癌患者癌組織中LINC00261 陽(yáng)性表達(dá)率越高，其中分化程度、TNM 分期是腫瘤惡性生物學(xué)行為的表現(xiàn)，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)，提示LINC00261 的異常表達(dá)可能預(yù)示著結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。由此，LINC00261 有可能作為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述，LINC00261 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯升高，與結(jié)直腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其有可能成為結(jié)直腸癌潛在的診斷標(biāo)志物。本研究在今后也將擴(kuò)大樣本收集量，以進(jìn)一步確認(rèn)LINC00261 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入研究。