楊穎，羅暉，馮杰，曾韡

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科·川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管疾病研究室；2.南充市中心醫(yī)院心胸外科，四川 南充 637000)

腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)及其并發(fā)的動(dòng)脈破裂是一類致命的血管性疾病，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其常見(jiàn)的病因[1]。AAA的主要病理改變?yōu)檠装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，血管平滑肌細(xì)胞凋亡，彈力纖維和膠原纖維斷裂，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解，從而導(dǎo)致動(dòng)脈管腔擴(kuò)張或膨出甚至發(fā)生破裂，造成嚴(yán)重出血，危及生命[2]。因此，如何抑制炎癥細(xì)胞的活化，阻止ECM降解是預(yù)防AAA的主要措施，也是目前尚未解決的臨床難題。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)A 型受體是配體門(mén)控氯離子通道超家族的成員，通常是由 α，β，γ，δ，ε，π，θ，ρ 8 類亞基組成的異源五聚體。這些亞基又組成眾多功能結(jié)構(gòu)特異的GABA-A受體。GABA激動(dòng)GABA-A受體后對(duì)腦內(nèi)抑制性神經(jīng)傳遞進(jìn)行調(diào)控[3]。近年來(lái)，研究[4]發(fā)現(xiàn)，GABA-A受體同樣表達(dá)于外周樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等細(xì)胞膜上，抑制炎癥免疫細(xì)胞的活性，延緩某些自身免疫性疾病的進(jìn)展。本小組既往研究[5]發(fā)現(xiàn)，在AS模型中，激活外周血單核-巨噬細(xì)胞膜表面的GABA-A受體可改善巨噬細(xì)胞內(nèi)失衡的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，上調(diào)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的比例，減輕載脂蛋白E缺乏(apoE-/-)小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。該結(jié)果提示，AS 與AAA同為血管炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制類似，炎癥免疫反應(yīng)貫穿始終[6]。本研究旨在探討GABA是否能夠通過(guò)其受體抑制腹主動(dòng)脈瘤小鼠未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cells iDCs)的遷移機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

C57BL/6J雄性小鼠(購(gòu)于川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，鼠齡6周，體重18～20 g。日夜節(jié)律變化條件為12 h光照和12 h黑暗，食物和飲水按需供給。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用都嚴(yán)格按照川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的動(dòng)物倫理學(xué)條例執(zhí)行。GABA購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理 彈性蛋白酶(PPE)構(gòu)建小鼠腹主動(dòng)脈瘤動(dòng)脈模型[7-8]：將小鼠麻醉后，打開(kāi)腹腔游離出腎動(dòng)脈以下髂動(dòng)脈分叉以上腹主動(dòng)脈段，依次結(jié)扎腹主動(dòng)脈分支，先行阻斷腹主動(dòng)脈近端，記錄阻斷時(shí)間，接著阻斷腹主動(dòng)脈遠(yuǎn)端，在灌注段腹主動(dòng)脈穿孔，接入PPE管，結(jié)扎固定，檢驗(yàn)灌注段腹主動(dòng)脈密閉性，PPE灌注濃度采用4.5 U/mL，維持灌注壓100 mmHg，灌注時(shí)間為5 min，灌注完畢后拔出PPE管，修復(fù)穿刺口，檢查若無(wú)出血，逐層關(guān)腹。手術(shù)時(shí)間40～60 min，建模周期14 d。腹主動(dòng)脈擴(kuò)張率(%)=(術(shù)后4周腹主動(dòng)脈直徑-灌注前腹主動(dòng)脈直徑)/灌注前腹主動(dòng)脈直徑×100%，以術(shù)后14 d腹主動(dòng)脈擴(kuò)張率50%以上作為診斷腹主動(dòng)脈瘤的標(biāo)準(zhǔn)。病理組織學(xué)檢測(cè)提示,細(xì)胞外基質(zhì)降解，平滑肌細(xì)胞減少或消失，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[9]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 獲取C57BL/6J腹主動(dòng)脈瘤小鼠骨髓來(lái)源的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。將小鼠脫頸處死，在無(wú)菌條件下分離小鼠股骨。用PBS將股骨中骨髓細(xì)胞沖洗出來(lái)直至股骨泛白。收集沖洗液使用細(xì)胞篩過(guò)濾。將過(guò)濾后的沖洗液移入15 mL離心管中，1 000 rpm離心5 min。倒去上清液，加入適量的紅細(xì)胞裂解液輕輕吹打混勻，4℃裂解 1～2 min。加入10～20 mL PBS混勻，離心棄上清。將沉淀加入無(wú)血清培養(yǎng)基6 mL吹打混勻后移至6孔板中，每孔1 mL，放入37℃培養(yǎng)箱孵育3 h后小心倒掉上清液，每孔分別加入2 mL完全培養(yǎng)基及CSF和IL-4各10 μL，放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。隔天換液并加入新的CSF和IL-4，第6天收集細(xì)胞液。從而獲得未成熟DCs細(xì)胞[10]。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將收集的未成熟DCs細(xì)胞接種至6孔板中，每孔加入細(xì)胞液1 mL；用移液槍吸取0.35 μL siRNA加入200 μL 1640培養(yǎng)基；加入15 μL轉(zhuǎn)染試劑，震蕩混勻后室溫下靜置15 min；混合液加入細(xì)胞液中后放入37℃培養(yǎng)箱孵育6 h，每孔加入新鮮完全培養(yǎng)基2 mL。Gabara5 SiRNA GGUGCGAACAGACAUCUAUTT；AUAGAUGUCUGUUCGCACCTT(購(gòu)于上海生工)。

1.2.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞離心，將細(xì)胞分為對(duì)照組(生理鹽水組)、GABA(200 nmol/L)組、Gabara5siRNA+GABA(200 nmol/L)組；上室中各加入細(xì)胞懸液100 μL，下室中加入500 μL完全培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱孵育2 h；PBS淋洗，4%多聚甲醛固定15 min，DAPI染色10 min，PBS洗滌3次；待干燥后熒光顯微鏡下觀察拍照，采用Image J軟件分析，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 熒光技術(shù)觀察細(xì)胞骨架 收集未成熟的DCs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，用移液槍抽吸細(xì)胞液1 mL接種于多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上，放入37℃培養(yǎng)箱孵育48 h；經(jīng)PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.25%Tritonx-100破膜，滴加稀釋好的鬼筆環(huán)肽至載玻片上，室溫避光孵育，PBS洗滌，待晾干后滴加抗熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察拍照顯示F-肌動(dòng)蛋白染色(F-actin)。

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè) GABAA受體α5亞基的表達(dá) 收集細(xì)胞轉(zhuǎn)染后iDCs，提取細(xì)胞蛋白，免疫組化BCA法測(cè)蛋白濃度，依次通過(guò)制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、染色、封閉、抗體孵育，最后化學(xué)發(fā)光、成像、分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(iDCs)的培養(yǎng)及純度

培養(yǎng)的第0天光學(xué)顯微鏡觀察顯示培養(yǎng)液中充滿大量圓形單核細(xì)胞；第2天觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)且有集落生成，部分細(xì)胞開(kāi)始伸出突起；第4天觀察發(fā)現(xiàn)集落數(shù)量增加，伸出突起的細(xì)胞數(shù)量增多；第6天觀察發(fā)現(xiàn)有大量細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，細(xì)胞周圍有長(zhǎng)短不一的突起。因單核細(xì)胞來(lái)源的iDC表達(dá)CD11c，CD11c-FITC抗體檢測(cè)iDC純度。在第6天收集細(xì)胞液后加入CD11c-FITC抗體標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞純度在80%左右。見(jiàn)圖1。

2.2 GABAA受體α5亞基SiRNA轉(zhuǎn)染情況

GABAA受體α5亞基SiRNA轉(zhuǎn)染率>90%。將iDCs分為空白組(生理鹽水組)、GABA組、轉(zhuǎn)染試劑組、NC-FAM組(NC組)、Gabara5siRNA組(SiRNA組)，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞利用Western blot檢測(cè)GABA-A受體α5亞基的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，GABA可以促進(jìn)GABA-A受體α5亞基表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而SiRNA干擾了GABAA受體α5亞基的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3 GABA通過(guò)GABA-A受體抑制iDCs的遷移

將iDCs分為空白組(生理鹽水組)、GABA組、Gabara5siRNA組(SiRNA組)，其中GABA組和SiRNA組分別加入200 nmol/L的GABA共孵育，利用transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，GABA組iDCs的個(gè)數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SiRNA組iDCs的個(gè)數(shù)較對(duì)照組無(wú)明顯變化，這些結(jié)果表明GABA對(duì)iDCs的遷移能力起負(fù)調(diào)節(jié)作用，并且可能是通過(guò)GABA-A受體α5亞基進(jìn)行的。見(jiàn)圖3。

2.4 GABA/GABA-A受體通路抑制iDCs偽足的形成

將GABA加入iDCs中共孵育1 h，激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，加入GABA后iDCs的偽足生成明顯減少。然后利用SiRNA敲低iDCs表面的GABA-A受體α5亞基后與GABA共孵育1 h，F(xiàn)-actin熒光染色結(jié)果顯示iDCs周圍有較多的偽足形成，并不受GABA的影響。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明GABA/GABA-A受體通路通過(guò)抑制iDCs偽足的形成來(lái)抑制細(xì)胞的遷移能力。見(jiàn)圖4。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，GABA/GABA-A受體通路可以抑制未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的遷移能力，當(dāng)利用SiRNA敲低GABA-A受體α5亞基表達(dá)后，GABA/GABA-A受體通路則不再抑制未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的遷移。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在GABA作用下，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞偽足生成明顯減少，提示了GABA/GABA-A受體通路可能通過(guò)抑制未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞偽足的生成來(lái)影響細(xì)胞的遷移。

研究[11]證實(shí)，敲除漿細(xì)胞樣DCs 基因的AAA模型小鼠，動(dòng)脈瘤的形成明顯減輕。在正常主動(dòng)脈，少量DCs存在于內(nèi)膜下并與平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸；但在承受血流渦流壓力較大的部位，如動(dòng)脈擴(kuò)張?zhí)?，大量成熟DCs呈簇狀聚集與T淋巴細(xì)胞接觸，進(jìn)行抗原呈遞，激活T淋巴細(xì)胞的致炎活性[12]。同時(shí)，富集于病變血管處的未成熟DCs開(kāi)始向血管外膜遷移，DCs胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)裝置骨架蛋白發(fā)生構(gòu)象改變，p38MAPK信號(hào)通路被激活，細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白絲切蛋白去磷酸化，肌動(dòng)蛋白單體在肌絲末端的解聚速度增加，DCs偽足伸出，遷移開(kāi)始[13-14]。隨著DCs到達(dá)ECM，除借助偽足穿行外，尚需分泌相關(guān)蛋白酶降解ECM。未成熟DCs主要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1、MMP-2、MMP-9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)-1等，分泌過(guò)程與MAPK信號(hào)途徑中p38/ERK1/2的磷酸化狀態(tài)有關(guān)[15]。因此，抑制成熟DCs的抗原呈遞功能，削弱未成熟DCs的遷移及分泌MMPs的能力可有效阻止動(dòng)脈瘤破裂。哺乳動(dòng)物骨髓來(lái)源的DCs胞內(nèi)含有GABA合成酶、GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和GABA-A受體亞基(α3，α5，β1，β3，ρ1)[4]。當(dāng)弓形蟲(chóng)感染DCs后，DCs內(nèi)合成的GABA通過(guò)自體分泌的方式作用于GABA-A受體，調(diào)控DCs的運(yùn)動(dòng)；此過(guò)程中，細(xì)胞表面GABA-A受體的亞基表達(dá)也發(fā)生變化，α3，β3 和 ρ1亞基的轉(zhuǎn)錄明顯增加[16]。另有研究[17]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元突觸表面的GABA-A受體通過(guò)胞吞和受體再循環(huán)，能夠在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)之間發(fā)生遷移，如亞基α5發(fā)生膜受體內(nèi)化后在埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin，ERM)家族中根蛋白的幫助下錨定肌動(dòng)蛋白，從而引發(fā)抑制性突觸可塑性的改變。

綜上，GABA/GABA-A受體通路可以抑制未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的遷移能力。后續(xù)本研究小組將在體外實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)研究GABA/GABA-A受體通路對(duì)腹主動(dòng)脈瘤小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞抗原提呈功能的影響，從而為腹主動(dòng)脈瘤的臨床治療尋找新的靶點(diǎn)。