夏珊，李生茂，張馨予，魯琴芮，李倩茹，敖慧

(1.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院·川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所，四川 南充 637000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1]。研究[2-6]發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油是川芎的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，主要含有以藁本內(nèi)酯等為代表的苯酞類、烯萜醇類及脂肪酸類等成分，有鎮(zhèn)靜、解熱、鎮(zhèn)痛、改善血液流變、抗氧化、降血壓、抗抑郁及抗缺血再灌注損傷等藥理活性，其中抗氧化是對(duì)抗腦缺血再灌注損傷的藥理作用機(jī)制之一[7-9]。目前，對(duì)川芎揮發(fā)油提取方法的研究主要有超臨界流體萃取法、水蒸氣蒸餾法、石油醚提取法、中性乙醇提取法、蒸餾-萃取耦合法和提取-共沸精餾耦合法等[10-11]，但多集中于比較不同方法提取的川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分差異，而對(duì)提取成分抗氧化活性差異的研究較少。本研究旨在比較水蒸氣蒸餾法(steam distillation，SD)、以石油醚為溶劑的索氏提取法(soxhlet extraction，SE)和超臨界CO2萃取法(supercritical CO2extraction，SFE-CO2)提取的川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分及抗氧化活性的差異，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

川芎藥材購(gòu)于成都五塊石中藥材批發(fā)市場(chǎng)，并經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院李毅主任中藥師鑒定為傘形科植物川芎(Ligusticum Chuanxiong)的干燥根莖。1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylphenylhydrazine，DPPH，美國(guó)sigma公司)、正己烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、無(wú)水硫酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、甲醇(成都市科龍化工試劑廠)和石油醚(成都市科龍化工試劑廠)均為分析純。Ohaus Discovery 1/100 000電子分析天平購(gòu)于奧豪斯儀器(上海)有限公司，Epoch 微孔板分光光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)BIOTEK 公司，Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀購(gòu)于美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 川芎揮發(fā)油的提取 取川芎粗粉過(guò)20目篩后提取。(1)SD[12]：取約200 g，置于2 000 mL圓底燒瓶中，加入1 200 mL蒸餾水，按《中國(guó)藥典》2015年版一部揮發(fā)油測(cè)定法(附錄XD甲法)進(jìn)行，水蒸氣蒸餾5 h，收集揮發(fā)油。(2)SE[13]：取約20 g，置于索氏提取器，加入200 mL石油醚(60～90℃)，提取3 h，濾過(guò)，濾液減壓濃縮，收集揮發(fā)油。(3)SFE-CO2[14]：取約30 g，于萃取斧溫度44℃、壓力4 000 PSI下萃取1 h，收集揮發(fā)油。

1.2.2 川芎揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量測(cè)定 取提取的川芎揮發(fā)油樣品，加正己烷稀釋，用無(wú)水硫酸鈉除去水分，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾；氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)分析測(cè)定(GC條件：載氣為氦氣；體積流量1.0 mL/min；程序升溫，初始溫度50℃，保持2 min；10℃/min速率升至120℃，保持8 min；5℃/min速率升至180 ℃，保持8 min；20℃/min速率升至260℃，保持4 min，分流進(jìn)樣，分流比：分流比1∶60；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度280℃)川芎揮發(fā)油的總離子流圖，通過(guò)工作站 NIST 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)檢索并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[15-17]，確定各色譜峰代表的化學(xué)成分，并按面積歸一化法計(jì)算各成分在揮發(fā)油中的相對(duì)含量。

1.2.3 川芎揮發(fā)油抗氧化活性檢測(cè) 通過(guò)測(cè)定川芎揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除率檢測(cè)其抗氧化活性[18-19]：稱取適量DPPH加甲醇配制成170 μmol/L的溶液，避光保存。取川芎揮發(fā)油樣品適量，加甲醇溶解并稀釋成一定濃度的供試品溶液，并取0.15 mL與0.15 mL DPPH溶液置96孔板，混勻后室溫避光放置60 min，517 nm處測(cè)定吸收度A1；同時(shí)測(cè)定0.15 mL供試品溶液+0.15 mL甲醇的吸收度A0，0.15 mL甲醇+0.15 mL DPPH溶液的吸收度A2。DPPH自由基清除率=[1-(A1-A0)/A2]×100%。以清除率(Y)對(duì)藥物濃度(x)進(jìn)行回歸，根據(jù)對(duì)數(shù)函數(shù)方程求出清除率為50%時(shí)藥物的濃度(IC50)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分

SD提取的川芎揮發(fā)油，檢測(cè)到44個(gè)色譜峰，鑒定其中32個(gè)色譜峰的峰面積之和占總峰面積的93.74%。其中，Z-藁本內(nèi)酯相對(duì)含量最高，占53.71%，其次是川芎內(nèi)酯(13.94%)、丁基苯酞內(nèi)酯(6.77%)、丁基苯酞(3.58%)和β-Selinene(2.97%)。在鑒定的化合物類型中，內(nèi)酯類(苯酞類)5個(gè)，峰面積之和占總峰面積的79.13%；烯類12個(gè)，占6.54%；酮類1個(gè)，占0.90%；醇類6個(gè)，占4.10%；酚類3個(gè)，占1.92%；脂肪酸及其酯類1個(gè)，占0.10%；其他類4個(gè)，占1.05%。SE提取的川芎揮發(fā)油檢測(cè)到23個(gè)色譜峰，鑒定其中18個(gè)色譜峰的峰面積之和占總峰面積的96.61%。其中，Z-藁本內(nèi)酯相對(duì)含量最高，占43.43%，其次是川芎內(nèi)酯(22.39%)、亞油酸(15.74%)、丁基苯酞內(nèi)酯(3.38%)、丁基苯酞(2.88%)。在鑒定的化合物類型中，內(nèi)酯類(苯酞類)6個(gè)，占74.08%；烯類5個(gè)，占3.56%；酚類1個(gè)，占0.68%；醇類2個(gè)，占0.59%；脂肪酸及其酯類2個(gè)，占16.13%；酰胺類1個(gè)，占1.42%；酮類1個(gè)，占0.15%。SFE-CO2提取的川芎揮發(fā)油檢測(cè)到30個(gè)色譜峰，鑒定其中21個(gè)色譜峰的峰面積之和占總峰面積的94.44%。其中，Z-藁本內(nèi)酯相對(duì)含量最高，占46.93%，其次是川芎內(nèi)酯(23.40%)、亞油酸(6.93%)、丁基苯酞內(nèi)酯(4.49%)、丁基苯酞(4.10%)。在鑒定的化合物類型中，內(nèi)酯類(苯酞類)5個(gè)，占80.13%；烯類7個(gè)，占4.32%；醇類2個(gè)，占0.69%；酚類1個(gè)，占0.25%；脂肪酸及其酯類6個(gè)，占9.05%。SD、SE及SFE-CO2提取的川芎揮發(fā)油有10個(gè)共有成分，分別為4-萜烯醇、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、β-Selinene、Espatulenol、丁基苯酞、丁基苯酞內(nèi)酯、川芎內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯、E-藁本內(nèi)酯和亞油酸甲酯，其中Z-藁本內(nèi)酯含量最高，分別為53.71%、43.43%和46.93%；10個(gè)共有成分相對(duì)含量之和分別為87.17%、76.58%和83.40%，且均以苯酞類為主，相對(duì)含量分別為79.13%、74.08%和80.13%。見(jiàn)表1、圖1及圖2。

表1 三種方法提取的川芎揮發(fā)油成分

2.2 川芎揮發(fā)油的PCA

表2 PCA特征值及累積方差貢獻(xiàn)率

2.3 川芎揮發(fā)油的抗氧化活性

SD、SE及SFE-CO2提取的川芎揮發(fā)油對(duì) DPPH自由基均有一定的清除作用，且清除率與劑量有依賴關(guān)系。對(duì)數(shù)回歸方程分別為YSD=0.2495ln(x)+0.9001，R2=0.9243、YSE=0.3186ln(x)+0.7772，R2=0.9962、YSFE-CO2=0.2585ln(x)+0.519，R2=0.9779；IC50值分別為0.20 mg/mL、0.42 mg/mL、0.93 mg/mL；三種方法提取川芎揮發(fā)油清除DPPH自由基的能力大小依次為SD>SE>SFE-CO2。見(jiàn)圖4。

3 討論

SD利用揮發(fā)油難溶于水且沸點(diǎn)較低，可隨水蒸氣蒸出來(lái)的原理提取，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、容易操作、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，是提取揮發(fā)油的經(jīng)典方法之一，但易破壞熱敏性成分，且能耗較大。SE利用揮發(fā)油易溶于石油醚、乙醇、正己烷、乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑的原理，通過(guò)有機(jī)溶劑減壓濃縮回收得到揮發(fā)油成分，耗能小、工藝簡(jiǎn)單，且揮發(fā)油得率相對(duì)較高，但所得揮發(fā)油多含有植物蠟、色素、脂肪等雜質(zhì)，并存在提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑使用量大、回收困難等不足。SFE-CO2是最近三十多年快速發(fā)展起來(lái)的一種提取揮發(fā)油的方法，具有提取溫度低、效率高、不破壞熱敏成分及無(wú)溶劑殘留等優(yōu)勢(shì)，但所需設(shè)備價(jià)格貴、運(yùn)行成本高[22-24]。

本研究采用GC-MS分析比較SD、SE和SFE-CO2提取的川芎揮發(fā)油，結(jié)果顯示，SD提取的川芎揮發(fā)油中化學(xué)成分?jǐn)?shù)量相對(duì)最多，為44個(gè)，SFE-CO2次之，為30個(gè)，SE相對(duì)最少，為23個(gè)。在鑒定的化學(xué)成分中，三種方法提取的川芎揮發(fā)油有10個(gè)共有成分，共有成分相對(duì)含量之和分別達(dá)87.17%(SD)、76.58%(SE)和83.40%(SFE-CO2)，且均以苯酞類化學(xué)成分為主，相對(duì)含量分別為79.13%、74.08%和80.13%，表明這三種方法提取的川芎揮發(fā)油主要化學(xué)成分相似，僅相對(duì)含量有所不相同。除共有成分外，不同方法提取的揮發(fā)油的化學(xué)成分種類也有一些差異。其中，SD提取的川芎揮發(fā)油烯類成分較多，如α-蒎烯、萜品油烯、γ-萜品烯、5-Pentylcyclohexa-1,3-diene、α-松油醇、β-Elemene、Tetradecamethylcycloheptasiloxane、β-Cadinene、Neoisolongifolene、γ-Selinene、1-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthalene、15-Copaenol、(-)-藍(lán)桉醇和角鯊烯等。而SE及SFE-CO2提取的揮發(fā)油中亞油酸等脂肪酸類較多，與文獻(xiàn)報(bào)道[12,15-17]基本一致。

PCA結(jié)果顯示，SE和SFE-CO2提取川芎揮發(fā)油化學(xué)成分較為相似，與SD差異相對(duì)較大。三種方法提取的川芎揮發(fā)油均具有一定的抗氧化活性，其清除DPPH自由基活性的大小順序依次為SD>SE> SFE-CO2，可能與SD提取的川芎揮發(fā)油中4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、α-蒎烯[25]、α-松油醇、γ-萜品烯[26]和角鯊烯[19]等具有較強(qiáng)清除DPPH自由基活性的成分有關(guān)。但川芎揮發(fā)油抗氧化的活性成分還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，SD、SE和SFE-CO2提取的川芎揮發(fā)油化學(xué)成分的種類、數(shù)量和抗氧化活性存在一定差異，但主要化學(xué)成分相似，僅相對(duì)含量有所不同。