戴菲，何怡曦，唐乙萍，董曾榮，周聞君，張全波，青玉鳳

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，1.高尿酸血癥與痛風(fēng)研究中心；2.風(fēng)濕免疫科；3.老年科，四川 南充 637000)

痛風(fēng)是機體嘌呤代謝障礙引起組織損傷的一組臨床綜合征，主要表現(xiàn)有高尿酸血癥、關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石、關(guān)節(jié)畸形、泌尿系結(jié)石及腎臟實質(zhì)性病變等[1]。流行病學(xué)研究[2]顯示，痛風(fēng)患病率逐年上升，因評估方法不同，全球各地患病率1%～6.8%。目前痛風(fēng)的具體發(fā)病機制尚不清楚。研究[1-4]發(fā)現(xiàn)，遺傳、免疫、環(huán)境因素以及飲食習(xí)慣等不同程度參與了痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展。血清尿酸(serum uric acid,sUA)水平升高被認為是痛風(fēng)發(fā)生的重要危險因素，研究[5]提示只有約10%的高尿酸血癥患者最終發(fā)展為痛風(fēng)。同時，痛風(fēng)患者容易并發(fā)糖尿病、高血壓、高血脂、心腦血管等疾病，對人體健康造成嚴重威脅。因此，闡明痛風(fēng)的確切發(fā)病機理及找尋原發(fā)性痛風(fēng)的早期診斷生物標記物，為早期診斷及治療痛風(fēng)提供有力的證據(jù)尤為重要。

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類新型非編碼RNA，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，廣泛且多樣地存在于真核細胞中[6]。在腫瘤、心血管疾病、自身免疫性疾病等發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[7-9]，但在痛風(fēng)中鮮有相關(guān)報道。為此，我們前期收集痛風(fēng)患者及健康對照者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)行circRNA微陣列表達譜檢測，發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)中有多個異常表達的circRNA[10]。本研究選取其中在急性痛風(fēng)患者中顯著高表達的hsa_circRNA_104633和顯著低表達的hsa_circRNA_406281兩個基因，擴大樣本量進行實時熒光定量多聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)實驗，檢測其在大樣本不同分期痛風(fēng)患者中的表達情況，初步探討hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在原發(fā)性痛風(fēng)中的差異表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年4月至2021年3月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的90例男性痛風(fēng)患者作為研究對象，其中急性期痛風(fēng)(active gout，AG)和間歇期痛風(fēng)(inactive gout，IG)患者各45例，平均年齡分別為(42.00±13.50)歲和(43.00±20.00)歲，所有痛風(fēng)患者均符合2015年ACR/EULAR制定的痛風(fēng)診斷標準[11]，且排除腎臟原發(fā)疾病、腫瘤、藥物等所致繼發(fā)性痛風(fēng)者。此外，AG患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、發(fā)熱、疼痛等癥狀不超過1周；IG患者至少有兩周沒有關(guān)節(jié)癥狀，并且炎癥指標，如紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細胞計數(shù)(white blood cell count，WBC)等在正常范圍內(nèi)。另選擇同期到川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心進行體檢的健康男性60例作為對照組(healthy controls,HC)，平均年齡為(43.50±17.75)歲，其實驗室指標均在正常范圍，且無痛風(fēng)病史及其他自身免疫性疾病、代謝性疾病等病史。三組研究對象年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。該研究獲得了川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，且所有參與者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實驗室常規(guī)指標的收集 采集所有研究對象清晨空腹外周靜脈血4 mL,于LH750血細胞分析儀及DxC800全自動生化儀(美國Beckman公司)檢測sUA、空腹血糖(fasting blood glucose，GLU)、炎癥及脂質(zhì)代謝指標水平。其中炎癥指標包括ESR，CRP，WBC，中性粒細胞粒計數(shù)(neutrophil granule count，GR)，淋巴細胞計數(shù)(lymphocyte count，LY)，單核細胞計數(shù)(monocyte count，Mo)；脂質(zhì)代謝指標包括血漿總膽固醇(plasma total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglycerides，TG)，高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)，低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)，極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein，VLDL)。上述所有指標為受試者就診時的常規(guī)檢查，且均在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床檢驗科進行。

1.2.2 hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281檢測 采用qRT-PCR法：收集所有研究對象肝素鈉抗凝的外周靜脈血2～3 mL，淋巴細胞分離液分離出PMBCs，根據(jù)Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取總RNA。采用紫外分光光度儀測定總RNA濃度及純度，選取吸光度值(A)260/280為1.8～2.0的標本，并以1‰DEPC水調(diào)整總RNA濃度至300 ng/mL。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書，取2μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后在LightCycle?96PCR儀(瑞士Roche公司)上進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體積為10 μL。包括5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，3.6ul ddH20，上下游引物各0.2 μL，1μL cDNA。以兩步法擴增，第一步：95℃ 30 s 1個循環(huán)→[95℃ 5 s→60℃ 34 s]40個循環(huán)。第二步：95℃ 15 s→60 60 s→95℃ 15 s 1個循環(huán)。本研究以β-actin作為內(nèi)參基因，所有PCR引物均由上海生工生物工程有限公司合成，β-actin上游引物序列：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，下游引物序列：5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAG-3′，擴增片段大小120bp；hsa_circRNA_104633上游引物序列：5′-AGTAACTGCTCCCCCTGAGGA-3′,下游引物序列：5′-GGGACTGCTGGCTCTGAAGT-3′，擴增片段大小180bp；hsa_circRNA_406281上游引物序列：5′-ACTGATGATGGAGGCTTCAGTGA-3′，下游引物序列：5′-TCTGCTTGGACACTGAAGGTTGA-3′，擴增片段大小170bp。每份標本均設(shè)2個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線。以2-△C(t)作為circRNA的相對表達水平來分析不同樣本間circRNA的差異表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 三組研究對象臨床特點及主要實驗室指標比較

三組對象年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。痛風(fēng)組(AG+IG)的炎癥指標如CRP、ESR、WBC、GR以及代謝指標如sUA、GLU、部分血脂相關(guān)指標等高于HC組(P<0.05)。AG組CRP、ESR、WBC、GR、Mo高于IG組(P<0.05)，兩組代謝指標比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此外，在IG組中，雖然所有炎癥指標均在正常范圍，但在正常范圍內(nèi)的WBC、GR、Mo數(shù)值均較正常HC組高(P<0.05)。見表1。

表1 三組研究對象的臨床特點及實驗室指標比較

2.2 三組研究對象hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281的表達水平比較

hsa_circRNA_104633在AG及IG組中的表達均高于HC組(P<0.005)，但AG與IG組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；hsa_circRNA_406281在AG組中的表達高于IG及HC組(P<0.05)，但IG與HC比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.3 通風(fēng)患者hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281基因表達水平與實驗室指標的關(guān)系

相關(guān)系分析顯示，hsa_circRNA_104633與sUA成正相關(guān)(r=0.305，P=0.003)，hsa_circRNA_406281與CRP、sUA呈負相關(guān)(CRP：r=-0.513，P<0.001；sUA：r=-0.213，P=0.043)。見表2。

表2 痛風(fēng)患者hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281的表達水平與實驗室指標的相關(guān)性

2.4 hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281對痛風(fēng)的診斷價值

ROC曲線顯示，hsa_circRNA_104633診斷痛風(fēng)的AUC為0.822(95%CI：0.756～0.888；P<0.001；敏感性=76.70%；特異性=78.30%)，與hsa_circRNA_406281比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?？紤]hsa_circRNA_406281在AG組的表達高于IG與HC組，推測其可能參與了急性痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)，成為痛風(fēng)潛在的炎癥標志物，故對其進行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)其AUC值為0.667(95%CI：0.576-0.759；P=0.001；敏感性為51.90%；特異性為84.10%)。見圖2。

3 討論

CircRNA可以充當miRNA海綿，影響蛋白質(zhì)翻譯，或與RNA結(jié)合蛋白相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的募集與組裝[6]。因此，circRNA的多功能性使其成為研究和預(yù)測疾病的理想之選。近年來，越來越多的研究表明，circRNA的失調(diào)與多種風(fēng)濕病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡[12]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[13]、骨關(guān)節(jié)炎等[14]，但在痛風(fēng)中鮮有相關(guān)報道。本課題組前期通過circRNA微陣列芯片篩選出與健康體檢者明顯差異表達的兩個circRNA分子hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281，通過查閱文獻，目前已有研究發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_104633可以被高遷移率族蛋白2調(diào)節(jié)，從而影響肺腺癌生長[15]。此外，關(guān)于hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在胃癌、神經(jīng)母細胞瘤、食管癌、肝臟寄生蟲等[16-19]相關(guān)疾病的微陣列芯片檢測中均有相關(guān)報道其差異表達，推測其可能參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究擴大樣本并通過PCR檢測了它們在痛風(fēng)人群及HC中的相對表達量，發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_104633在痛風(fēng)患者PBMCs的表達顯著增高，而hsa_circRNA_406281則顯著降低，提示兩個circRNA可能在痛風(fēng)的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。

痛風(fēng)是一種炎癥性疾病，其急性炎癥反復(fù)發(fā)作且可自發(fā)緩解的機制是當今痛風(fēng)炎癥機制研究中的熱點問題[20]。本研究發(fā)現(xiàn)即使間歇期痛風(fēng)患者炎癥指標處于正常范圍，但其炎癥指標水平仍高于HC組，間接說明了即使在在痛風(fēng)穩(wěn)定期，痛風(fēng)患者體內(nèi)仍然存在低水平的炎性活動。此外，痛風(fēng)也是一種代謝性疾病，流行病學(xué)調(diào)查顯示，痛風(fēng)與高尿酸血癥，高脂血癥，高血糖等密切相關(guān)[3]，sUA水平升高被認為是痛風(fēng)發(fā)生的重要危險因素[1,5]，高尿酸血癥是高血壓病、冠心病、糖尿病等代謝性疾病的獨立危險因素之一。研究發(fā)現(xiàn)[1,21-23]尿酸代謝紊亂與脂代謝或者糖代謝可能互為因果，一方面脂肪代謝產(chǎn)生的酮體可阻礙sUA排泄，間接使sUA水平增高，而sUA水平升高可降低脂蛋白酶活性，影響脂質(zhì)代謝。另一方面，sUA持續(xù)升高可損害胰腺B細胞功能，出現(xiàn)胰島素抵抗，而持續(xù)的高血糖狀態(tài)可使機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，損傷血管內(nèi)皮，促使血管平滑肌細胞增殖，可引起腎小球動脈硬化，腎血流量減少，上述過程可導(dǎo)致sUA排泄障礙，使sUA水平增高。而circRNA作為非編碼RNA的一種，在調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)及代謝性疾病中發(fā)揮著重要作用：如近期發(fā)現(xiàn)，肝臟成纖維細胞中脂質(zhì)暴露引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致線粒體中circRNA SCAR表達量下降，原本與其結(jié)合的ATP合成酶β5轉(zhuǎn)而與親環(huán)素D蛋白結(jié)合，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔通道開放，使線粒體中的活性氧自由基釋放到胞質(zhì)中，加重非酒精性脂肪性肝炎[24]；另有研究表明circHIPK3可競爭性結(jié)合miR-192-5p從而上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FOXO1導(dǎo)致高血糖和胰島素抵抗[25]；Circ_0001103可調(diào)控miR-375以及去乙?；?來改善炎癥因子IL-1 β誘導(dǎo)的軟骨細胞損傷[26]。本研究從炎癥、尿酸代謝、脂代謝、糖代謝方面選擇上述實驗室指標與兩個circRNA分子在痛風(fēng)患者中的相對表達量進行了相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_104633與sUA成正相關(guān)，hsa_circRNA_406281與CRP、sUA呈負相關(guān)，提示hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281可能參與痛風(fēng)患者的尿酸代謝調(diào)節(jié)，且hsa_circRNA_406281還可能參與了痛風(fēng)炎癥調(diào)節(jié)，其具體機制有待進一步研究。

隨著人們生活水平的提高，痛風(fēng)已是我們生活中的常見病、多發(fā)病。大部分AG患者伴有高尿酸血癥，但仍有部分痛風(fēng)患者sUA水平在正常范圍，一項關(guān)于221名AG患者的回顧性隊列研究中發(fā)現(xiàn)約40%的痛風(fēng)患者急性期無sUA水平的升高[27]。目前在偏振光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)MSU晶體仍是診斷痛風(fēng)的金標準，但是，作為一項有創(chuàng)操作，臨床應(yīng)用很少，特別是對于沒有高尿酸血癥的痛風(fēng)患者，MSU的檢出率非常低，因此尋找有效的痛風(fēng)診斷標志物及治療靶標至關(guān)重要。CircRNA具有獨特的結(jié)構(gòu)，高穩(wěn)定性和特定的表達方式，近年來，越來越多的證據(jù)表明circRNA可以作為多種疾病的新型診斷標志物，如組織樣品中circ-PSD3可能是甲狀腺乳頭狀癌的潛在診斷生物標志物[28]；circFKBP8和circMBNL1在外周血中異常表達可能是診斷重度抑郁癥的生物標志物[29]；全血中hsa_circ_0082688和hsa_circ_0082689可作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷生物標記[12]。然而，目前沒有關(guān)于使用circRNA作為痛風(fēng)的生物標志物的報道。體液是診斷多種人類疾病的常用材料，尤其是外周血在診療疾病方面具有獨特的優(yōu)勢。由于保守的共價閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，circRNA對RNA酶具有較高的抵抗性，使其在體液或外周血中得以富集[6]。在本研究中，痛風(fēng)組PBMCs中hsa_circRNA_104633的表達水平顯著高于HC組。通過ROC曲線進一步分析了它們的診斷價值顯示hsa_circRNA_104633的曲線下面積大于0.8，可以很好的將痛風(fēng)患者和健康人群區(qū)分開。這表明hsa_circRNA_104633可能具有作為痛風(fēng)生物標志物的潛力。但是，需要更大的樣本量及不同人群的比較進一步證實我們的結(jié)果。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_104633和hsa_circRNA_406281在痛風(fēng)患者PBMCs中異常表達，提示其可能參與痛風(fēng)發(fā)病，進一步分析發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_104633的表達量與痛風(fēng)患者血尿酸濃度呈正相關(guān)，而hsa_circRNA_406281則與血尿酸濃度呈負相關(guān)，提示這兩個circRNAs可能參與痛風(fēng)患者尿酸代謝的調(diào)節(jié)；同時發(fā)現(xiàn)hsa_circRNA_406281的表達量與CRP呈負相關(guān)，提示hsa_circRNA_406281可能還與痛風(fēng)炎癥調(diào)節(jié)密切相關(guān)。此外，hsa_circRNA_104633能很好的將痛風(fēng)患者與HC區(qū)分開，在痛風(fēng)臨床診斷和治療中可能具有潛在的用途。但是本研究也存在一些局限性，未來的研究將通過擴大樣本量、設(shè)置疾病組對照、進行功能實驗等來進一步明確它們在痛風(fēng)中的分子機制和特定功能。