范浩博，唐秀平，楊麗源，宋唯琦，王英，陳思宇，鄒云春

(川北醫(yī)學(xué)院眼視光學(xué)系，四川 南充 637000)

弱視是造成當(dāng)今世界上兒童視力下降的重要疾病之一[1]，亞洲地區(qū)的發(fā)病率約1.09%[2]。近年來，隨著分子生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等多學(xué)科在弱視致病機制方面的研究深入，目前研究[3-4]證實，弱視治療的基本依據(jù)在于視覺發(fā)育敏感期內(nèi)視覺可塑性的存在，而視覺發(fā)育可塑性機制與多種神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)，但具體發(fā)病機制尚未完全闡明，還不能在分子水平上詳細解釋弱視關(guān)鍵期及可塑性發(fā)生的變化。突觸目前被認為是弱視的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其可塑性按時間上可分為長時程增強(long-termpotentiation，LTP)和長時程抑制(long-termdepression，LTD)。而早期生長反應(yīng)因子-1(early growth responsive gene-1，Egr-1)作為即刻早期基因(Immediate-early genes，IEGs)中Egr家族內(nèi)的一員，具有編碼鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子的作用。在突觸可塑性和記憶的鞏固以及LTP的誘導(dǎo)和學(xué)習(xí)過程中都伴隨著Egr-1表達的增加[5]；同時，Egr-1也具有將短時程信號與長時程改變進行偶聯(lián)的效應(yīng)，但目前尚未有研究表明Egr-1的表達與弱視的關(guān)聯(lián)。本研究通過觀察形覺剝奪性弱視幼貓視皮質(zhì)Egr-1的表達，探討Egr-1對視覺發(fā)育的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取3周齡幼貓30只，性別、毛色不限，體重240～350 g，眼底鏡檢查排除屈光介質(zhì)混濁及眼底異常；檢影驗光顯示幼貓屈光度為+1.25～+3.25 D。由于幼貓在年齡較小階段尚無法自主攝取固態(tài)食物，故采取人工定時喂養(yǎng)貓奶粉與飲水的方式進行飼養(yǎng)，每日喂食4～5次，保證其健康成長。待其能夠自主攝食后，每日早中晚共計3次，檢查貓糧與飲水的供應(yīng)，以保證食物的充沛。飼養(yǎng)房間內(nèi)溫度設(shè)定為(24±1)℃，相對濕度保持在50%，房間內(nèi)各處均能夠接受自然光線照射。本研究動物均由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，通過川北醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準并全程接受監(jiān)督。

1.1.2 實驗試劑與儀器 主要試劑：PBS(PH 7.2～7.6)緩沖液(武漢Boster公司，貨號：AR0030)、枸櫞酸鹽(PH 6.0)緩沖液(武漢Boster公司，貨號：AR0024)、Egr-1抗體(Bioss公司，貨號BS-1076R)、SABC免疫組化染色試劑盒(武漢Boster公司，貨號：SA1022)、DAB顯色試劑盒(武漢Boster公司，貨號：AR1022)、Mayer`蘇木素染液(Solarbio公司，貨號：G1080)、伊紅染色液(Solarbio公司，貨號：G1100)。主要儀器：動物電極針(法國羅蘭，型號：RL-1223000030-RC-D)、視覺電生理儀(法國羅蘭，型號：RETI port/scan 21)、帶狀檢影鏡(蘇州六六，型號：YZ24B)、病理切片機(Leica，型號：RM2235)、顯微成像系統(tǒng)(尼康，型號：DS-Fi2)

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 隨機數(shù)字表法將幼貓分為形覺剝奪組與對照組，每組15只。采用1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉兩組幼貓。對照組僅做麻醉處理；剝奪組在麻醉后采用“套環(huán)遮蓋法”[6]進行弱視造模：將3-0線在其右眼眼眶四周對稱做四個小套環(huán)，用縫線穿過套環(huán)連接黑色不透明遮蓋布，并于中央制作了一個高約0.7 cm，直徑為3 cm的環(huán)形遮蓋圈，防止光線從側(cè)面透過(圖1A)。剝奪組遮蓋前與遮蓋后的第1、3、5周，對剝奪組幼貓右眼、左眼與對照組右眼行圖形視覺誘發(fā)電位(pattern visual evoked potential，PVEP)檢測。PVEP檢測需矯正幼貓屈光不正，檢測前將幼貓遮蓋布套環(huán)上的連接線剪斷，取下遮蓋布，采用帶狀檢影鏡進行檢影驗光以確定幼貓雙眼屈光度(圖1B)。PVEP檢測時，將三根動物電極針分別依次插入：參考電極(藍色)置于前額正中皮下，作用電極(紅色)置于雙耳連線枕部皮膚正中皮下，接地電極(黑色)置于耳尖皮下。調(diào)整幼貓頭位使其被檢測眼視軸與屏幕中央處于同一水平線上(圖1C)。PVEP采用棋盤翻轉(zhuǎn)模式進行刺激，距離為50 cm，刺激模式設(shè)定為0.3 cpd，視角16.7°，時間頻率為1 Hz，對比度97%，采樣時間300 ms，疊加64次。并根據(jù)此前檢影驗光結(jié)果，選取相應(yīng)鏡片對其屈光不正進行足矯，于暗室條件下進行檢測，每只眼重復(fù)三次取平均值。檢測過程中隨時觀察并調(diào)整幼貓頭位使其檢測眼視軸與屏幕中央處于同一水平線上。檢測后記錄剝奪組幼貓右眼、左眼與對照組幼貓右眼的P100波振幅與潛伏期。動物弱視模型建立的成功標準以剝奪組右眼與剝奪組左眼、剝奪組右眼與對照組右眼之間P100波振幅與潛伏期存在統(tǒng)計學(xué)時即認為弱視造模成功[7-8]。

1.2.2 取材與切片制作 遮蓋后第5周PVEP檢查完成后，根據(jù)《貓解剖彩色圖譜》將所有幼貓進行視皮質(zhì)與外側(cè)膝狀體取材：使用解剖刀從枕外隆突處向前額骨處劃開皮膚，剝離顱骨外軟組織，使顱骨面暴露(圖2A)。使用直剪從枕骨處剪開顱骨，并向前端繼續(xù)分離兩側(cè)顱骨，直至腦組織完全暴露。用組織剪剪斷腦部組織與脊髓處的連接，用鑷子輕輕提起整個腦組織，從腦組織下方可看見視交叉，剪斷視交叉后，即可使整個腦部組織脫離。由背視視角即可見端腦枕回(圖2B)；由腹視視角可見端腦梨狀葉，分離梨狀葉，暴露外側(cè)膝狀體(圖2C)。隨后快速切下端腦枕回與間腦外側(cè)膝狀體部，并立即將其放入4 %多聚甲醛固定液(含DEPC)中固定，隨后脫水包埋。采用石蠟切片機進行切片，切片厚度設(shè)定為4 μm。

1.2.3 HE染色及免疫組化 HE染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加蘇木素染液，1%鹽酸酒精分化后，滴加伊紅染液，脫水封片。顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。免疫組化：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3 % H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，微波熱修復(fù)抗原，5 % BSA封閉液封閉，滴加一抗，滴加生物素標記山羊抗兔IgG，滴加SABC，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，脫水封片，顯微成像系統(tǒng)下進行圖像采集分析陽性細胞數(shù)與陽性細胞平均光密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PVEP檢測

PVEP檢測顯示，幼貓PVEP主波圖像表現(xiàn)為N75-P100-N135復(fù)合波，該波具有兩個正向波與一個負向波共同構(gòu)成，呈“M”狀(圖2.1)。遮蓋前，剝奪組右眼、左眼與對照組右眼在P100波潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；遮蓋3周后，三組P100波潛伏期與振幅差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；剝奪組右眼P100波潛伏期高于剝奪組左眼與對照組右眼(P<0.05)；剝奪組右眼振幅低于剝奪組左眼與對照組右眼(P<0.05)；遮蓋5周后，剝奪組右眼P100波潛伏期高于剝奪組左眼與對照組右眼(P<0.05)；剝奪組右眼振幅低于剝奪組左眼與對照組右眼(P<0.05)。提示遮蓋3周后，剝奪組幼貓右眼已形成單眼形覺剝奪性弱視。見圖3、圖4、表1及表2。

表1 各組遮蓋前后P100波振幅變化

表2 各組遮蓋前后P100波潛伏期變化

2.2 HE染色

HE染色顯示，遮蓋5周后，對照組幼貓視皮層神經(jīng)元細胞形態(tài)以多角形、不規(guī)則型居多，細胞間結(jié)構(gòu)緊密；形覺剝奪組視皮層神經(jīng)元細胞形態(tài)多為圓形，少數(shù)呈不規(guī)則狀；局部膠質(zhì)細胞增生，海綿狀變性，部分神經(jīng)元水腫、變性。見圖5。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測

免疫組化檢測結(jié)果表明，遮蓋5周后兩組幼貓大腦視皮質(zhì)中均有Egr-1的陽性信號，即存在Egr-1表達，表達位于細胞胞漿之中，呈棕黃色，細胞核呈藍色。剝奪組中大部分呈現(xiàn)陽性或弱陽性，陽性細胞數(shù)較少；對照組表達強陽性信號較強；剝奪組陽性細胞數(shù)與平均光密度均低于對照組(P<0.05)。見表3及圖6。

表3 免疫組織化學(xué)檢測

3 討論

形覺剝奪性弱視是由于嬰幼兒時期，因先天性白內(nèi)障、上瞼下垂、角膜白斑等原因，使光線不能或不正常進入眼內(nèi)，剝奪了黃斑接受正常光線刺激的機會。其生理性刺激的減少，使處于發(fā)育期內(nèi)的黃斑產(chǎn)生發(fā)育不良或停滯[1]。對于幼貓而言，形覺剝奪對其視力的影響一般在出生后至4周齡時達到頂峰，在12周齡后，遮蓋產(chǎn)生的形覺剝奪幾乎不能夠?qū)ζ湟暳Πl(fā)育進行干擾[9]。因此，選用3周齡的幼貓通過單眼形覺剝奪的方式建立弱視模型。目前，形覺剝奪性弱視造模的經(jīng)典方法為上瞼縫合法，本小組既往曾采用“套環(huán)遮蓋法”[10]，即利用黑色遮蓋布替代眼瞼縫合進行弱視造模。在避免眼瞼縫合對眼前節(jié)產(chǎn)生損傷的同時，利用剪斷連接線實現(xiàn)了對實驗動物PVEP變化的連續(xù)觀察。該方法可以有效阻擋動物遮蓋眼各方向的光線進入眼內(nèi)，并順利建立弱視動物模型。但造模期間內(nèi)仍出現(xiàn)個別幼貓頭部運動導(dǎo)致遮蓋布側(cè)方有光線透過。為改進這一情況，本實驗在原遮蓋方法上加大了遮蓋布的直徑，并在遮蓋布中央制成具有一定高度的黑色不透明遮蓋環(huán)，以進一步提升遮蓋效能。

本實驗PVEP檢測采用棋盤翻轉(zhuǎn)刺激，記錄到幼貓PVEP主波圖像由兩個正向波與一個負向波構(gòu)成，呈“M型”。通過比對同時間不同眼與同眼不同時間P100波振幅與潛伏期，提示改良后的遮蓋方法是可行有效的。通過“套環(huán)遮蓋法”能夠成功建立單眼形覺剝奪性弱視動物模型，并能實現(xiàn)對實驗動物的眼部生理參數(shù)動態(tài)檢測。

隨著近年來弱視研究深入開展，多種參與視覺發(fā)育可塑性機制的神經(jīng)遞質(zhì)，如AMPA受體及其GluR2亞基、NEP1-40、突觸素、膽堿能神經(jīng)元、生長相關(guān)蛋白-43、GABA、cPKC-r、NMDAR、NGR-1等[11]都被認為與弱視相關(guān)，但仍然不能完全從分子水平上解釋弱視關(guān)鍵期與其可塑性變化的關(guān)系[3-4]。即刻早期基因作為一類可編碼轉(zhuǎn)錄因子的原癌基因[12],具有偶聯(lián)短時程信號與長時程改變的效應(yīng)，主要包括C-fos、Egr家族以及Arc等,其中有不少轉(zhuǎn)錄因子都受到視覺活動的調(diào)節(jié)。其中，已有充分證據(jù)顯示C-fos與弱視疾病的關(guān)聯(lián)性。即刻早期基因中Egr家族內(nèi)的Egr-1[13]，其轉(zhuǎn)錄因子在視皮層可塑性變化中是必需的。Egr-1是一種編碼鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在突觸可塑性和記憶鞏固及LTP的誘導(dǎo)和學(xué)習(xí)過程中，都伴隨著Egr-1表達增加[5]。而細胞骨架相關(guān)基因Arc作為Egr-1的靶基因之一，是一個突觸活性誘導(dǎo)的效應(yīng)分子，在晚期LTP中具有重要作用。有研究[13]表明，一定條件下，Egr-1可以調(diào)控海馬CA1區(qū)晚期活性依賴性Arc基因轉(zhuǎn)錄，即刻早期基因Arc因其具有多能、精細調(diào)諧系統(tǒng)，能夠連接神經(jīng)活動的變化模式和突觸可塑性，從而優(yōu)化神經(jīng)系統(tǒng)信息存儲。本實驗利用HE染色與免疫組化分別對遮蓋5周后的弱視幼貓視皮質(zhì)與對照組視皮質(zhì)的組織形態(tài)學(xué)差異和Egr-1蛋白表達進行了對比與分析。提示在弱視幼貓模型中，視皮層神經(jīng)元細胞組織形態(tài)發(fā)生變化，并且伴隨局部膠質(zhì)細胞增生。既往弱視動物模型的研究[14-15]發(fā)現(xiàn)弱視動物的神經(jīng)節(jié)細胞、外側(cè)膝狀體、視皮質(zhì)都存在結(jié)構(gòu)方面的變化，并伴隨著突觸密度下降，這些結(jié)構(gòu)上的變化，又會導(dǎo)致其功能方面進一步改變。本實驗研究結(jié)果提示在視覺發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)，由于雙眼視覺不對等輸入，可能會導(dǎo)致視皮質(zhì)細胞數(shù)目及形態(tài)發(fā)生變化，從而Egr-1蛋白表達下降，而Egr-1蛋白表達下降又進一步對視皮質(zhì)的正常生理功能產(chǎn)生異常影響，影響視覺發(fā)育，從而促進了弱視的發(fā)生發(fā)展。

視皮層軸突水平的興奮與抑制的平衡是維持視皮層正常發(fā)育和功能的條件，也是影響視覺系統(tǒng)可塑性的重要因素[16]。視神經(jīng)沖動在腦的第一個突觸接替發(fā)生在外側(cè)膝狀體(LGN)，每側(cè)的LGN接收來自同側(cè)視網(wǎng)膜顳側(cè)半視纖維和來自對側(cè)視網(wǎng)膜鼻側(cè)半視纖維的投射，這種投射具有嚴格的局部區(qū)域?qū)?yīng)關(guān)系。神經(jīng)的可塑性主要表現(xiàn)于突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性。弱視發(fā)生與突觸可塑性改變有關(guān)，弱視產(chǎn)生過程中會產(chǎn)生長時程改變，Egr-1和Arc基因與突觸長時程改變密切相關(guān)。目前多數(shù)研究也表明知覺學(xué)習(xí)可以提高弱視患者的視覺功能[17]，知覺學(xué)習(xí)是通過反復(fù)的視覺刺激，以及具有監(jiān)督和反饋作用的視覺體驗，使視功能得到有效的恢復(fù)[18]。研究者發(fā)現(xiàn)其機制可能與可塑性相關(guān)的興奮和抑制平衡有關(guān)聯(lián)，而Egr-1和Arc又在人與動物的學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用[19]。本實驗研究進一步證實了在弱視發(fā)病過程中，視皮質(zhì)的Egr-1蛋白表達會產(chǎn)生下降，進一步驗證了知覺學(xué)習(xí)在弱視治療中的作用。

綜上所述，采用套環(huán)遮蓋法可以實現(xiàn)弱視動物模型的建立和眼球參數(shù)的動態(tài)測量?；谶@一方法所制作的弱視動物模型，發(fā)現(xiàn)Egr-1在視皮質(zhì)的表達明顯下降。本實驗推測Egr-1在視覺發(fā)育過程中起到了重要作用。本研究為進一步探索單眼形覺剝奪是如何調(diào)控視皮層神經(jīng)元，為治療弱視與深入了解其發(fā)病機制提供了新的思路與方向。