岳瀚勛，余嫻，趙軒，雍琴

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院I期臨床試驗(yàn)研究室，重慶 400010；2.中國(guó)平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院，河南 平頂山 467000)

目前，乳腺癌已取代肺癌成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。隨著對(duì)乳腺癌研究的深入，越來(lái)越多的治療手段被應(yīng)用于臨床，如化療、免疫治療、靶向治療等[2]。但三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)作為乳腺癌中一種特殊類型，其治療仍主要為含鉑兩藥聯(lián)合化療[3]。盡管聯(lián)合化療已明顯提高療效和降低不良反應(yīng)，但由于藥物本身毒性大和治療缺乏靶向性，導(dǎo)致其不良反應(yīng)仍較多且難以耐受[4-6]?？朔@些問(wèn)題的有效方法之一就是選擇毒性低的藥物并將其封裝于具有靶向作用的納米載體中形成納米藥物。槲皮素是一種黃酮類天然化合物，廣泛存在于日常飲食中，具有顯著抗腫瘤作用和良好的安全性[7]。但槲皮素有口服生物利用度低、水溶性差、代謝迅速及易被酶降解等缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。對(duì)槲皮素進(jìn)行改性是解決上述問(wèn)題的有效方法，包括形成金屬配合物[8]。銅離子是一種能與槲皮素發(fā)生配位作用的副族金屬，研究[9]表明，槲皮素-銅配合物具有明確的抗腫瘤作用。此外，銅離子也可通過(guò)觸發(fā)類芬頓反應(yīng)將腫瘤微環(huán)境中過(guò)量產(chǎn)生的低毒性過(guò)氧化氫(H2O2)轉(zhuǎn)化成更具細(xì)胞毒性的羥基自由基(·OH)來(lái)達(dá)到協(xié)同抗腫瘤作用[10]。低分子量透明質(zhì)酸作為一種高效的腫瘤靶向遞送載體，其優(yōu)越性主要體現(xiàn)在具有良好的生物相容性、生物可降解性和特殊的CD44受體結(jié)合能力[11]。在生理?xiàng)l件或適當(dāng)pH環(huán)境下通過(guò)透明質(zhì)酸分子中糖醛酸的羧基充分解離，然后與銅離子形成離子對(duì)，可使槲皮素-銅配合物靶向高表達(dá)CD44受體的腫瘤細(xì)胞。本研究擬將槲皮素作為化學(xué)治療劑和自載材料，銅離子作為連接點(diǎn)和類芬頓反應(yīng)試劑，透明質(zhì)酸作為靶向遞送載體，利用上述材料自組裝形成配位聚合物納米粒的方法開(kāi)發(fā)一種具有多功能的透明質(zhì)酸-銅-槲皮素配位聚合物納米粒(hyaluronic acid-cu-quercetin coordination polymer nanoparticles，HCQ NP)并闡明其體外抗三陰人乳腺癌的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

槲皮素(Sigma-Aldrich公司)，氯化銅(梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，透明質(zhì)酸(Lifecore Co.(Chaska,MN))，Tris-Hcl 8.8(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，重慶塞米克)，亞甲藍(lán)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(MCE公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶細(xì)胞消化液(重慶塞米克)，三陰人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231來(lái)自于重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。人正常肝組織細(xì)胞LO2細(xì)胞來(lái)自于廈門大學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 HCQ NP的合成及表征 HCQ NP的合成采用自組裝方法，具體如下：吸取1 mL透明質(zhì)酸溶液(10 mg/mL)和150 μL氯化銅溶液(5 mg/mL)于反應(yīng)瓶中，并將其置于磁力攪拌器上以500 rpm攪拌反應(yīng)4 min；然后吸取150 μL Tris-Hcl 8.8溶液加入反應(yīng)瓶中反應(yīng)4 min，以促進(jìn)透明質(zhì)酸與銅離子充分反應(yīng)；吸取125 μL 槲皮素溶液(20 mg/mL)逐滴加入到反應(yīng)瓶中反應(yīng)4 h；最后將上述反應(yīng)液透析24 h并于室溫下保存?zhèn)溆谩CQ NP樣品和經(jīng)過(guò)硝化和干燥處理的樣品分別進(jìn)行透射電鏡、動(dòng)態(tài)光散射、電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)和紅外光譜(fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR)檢測(cè)，測(cè)定HCQ NP的形態(tài)、粒徑、樣品中銅離子的含量及納米粒的結(jié)構(gòu)。

1.2.2 HCQ NP生成羥基自由基能力的檢測(cè) 采用亞甲藍(lán)光度法。設(shè)置HCQ NP組(HCQ)；HCQ NP+1nM H2O2組[HCQ+H2O2(1nM)]；HCQ NP+2nM H2O2組[HCQ+H2O2(2nM)]；HCQ NP+4nM H2O2組[HCQ+H2O2(4nM)]，亞甲藍(lán)溶液組(methylene blue，MB)為空白對(duì)照。將上述各組與亞甲藍(lán)溶液放置于37 ℃避光條件下孵育30 min；使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)依次測(cè)量各組亞甲藍(lán)在波長(zhǎng)666 nm處的吸光度。

1.2.3 HCQ NP的抗乳腺癌作用檢測(cè) 采用CCK-8法。設(shè)置5 μL HCQ NPs組(HCQ)和5 μL HCQ NP +50μM H2O2組(HCQ+H2O2)；10 μL HCQ NPs組(HCQ)和10 μL HCQ NP +50 μM H2O2組(HCQ+H2O2)；15 μL HCQ NPs組(HCQ)和15 μL HCQ NP +50 μM H2O2組(HCQ+H2O2)；20 μL HCQ NPs組(HCQ)和20 μL HCQ NP +50μM H2O2組(HCQ+H2O2)，PBS組為空白對(duì)照組；MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板(3×103/孔)中，加入正常培養(yǎng)基貼壁24 h后，吸出原有培養(yǎng)基，各組分別加入正常培養(yǎng)基(含89%RPMI-1640，10%胎牛血清，1%雙抗)及各組相應(yīng)處理因素；置于5% CO2、37 ℃條件下的孵箱中培養(yǎng)48 h；將各組培養(yǎng)基棄去，加入含有10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)各組吸光度。

1.2.4 HCQ NP的生物相容性檢測(cè) 采用CCK-8法。設(shè)置5 μL HCQ NPs組(HCQ)；10 μL HCQ NPs組(HCQ)；15 μL HCQ NPs組(HCQ)；20 μL HCQ NPs組(HCQ)，PBS組為空白對(duì)照組；LO2細(xì)胞接種于96孔板(3×103/孔)中，加入正常培養(yǎng)基貼壁24 h后，吸出原有培養(yǎng)基，各組分別加入正常培養(yǎng)基(含89% RPMI-1640,10%胎牛血清，1%雙抗)及各組相應(yīng)處理因素；置于5% CO2、37 ℃條件下的孵箱中培養(yǎng)48 h；將各組培養(yǎng)基棄去，加入含有10%CCK-8試劑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)各組吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HCQ NP的表征

透射電鏡觀察顯示，HCQ NP的形狀類似球形，大小均一。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)的粒徑結(jié)果比透射電鏡的大的主要原因是動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)的是納米粒的水合粒徑。HCQ NP經(jīng)硝化處理后通過(guò)ICP-MS測(cè)得銅離子濃度為6.663 mg/L，根據(jù)硝化處理時(shí)的稀釋比例計(jì)算得合成的HCQ NP 樣品中銅離子濃度為133.262 mg/L。將經(jīng)干燥處理后得到的 HCQ NP粉末進(jìn)行紅外檢測(cè)，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)HCQ NP的紅外吸收光譜上存在槲皮素及透明質(zhì)酸的特征吸收峰，但有部分偏移，槲皮素中羰基(C=O)的振動(dòng)頻率位于1 661 cm-1，制備成納米粒后C=O向低波數(shù)方向發(fā)生位移，表明槲皮素羰基參與了配位作用。相比于槲皮素振動(dòng)頻率位于1 308 cm-1的C-OH(C-3位)，納米粒中消失，表明該結(jié)構(gòu)也參與了與銅離子的配位[12]。見(jiàn)圖1、圖2及表1。

表1 HCQ NP的粒徑和zeta電位徑

2.2 HCQ NP生成羥基自由基的能力

檢測(cè)HCQ NP生成羥基自由基能力，結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組和HCQ NP組，HCQ NP+ H2O2組更能生成羥基自由基，導(dǎo)致MB吸光度下降，且隨著H2O2濃度的提高，MB的吸光度也降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.3 HCQ NP的協(xié)同抗腫瘤作用

HCQ組和HCQ+H2O2組對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.05)，HCQ+H2O2組強(qiáng)于HCQ組(P<0.05)，且隨著劑量的增大，抑制作用也隨之加強(qiáng)。見(jiàn)圖4。

2.4 HCQ NP的生物相容性

相對(duì)于對(duì)照組，HCQ組在不同劑量下均未對(duì)LO2細(xì)胞產(chǎn)生明顯的影響(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

3 討論

TNBC作為乳腺癌中一種特殊類型，具有高侵襲和高轉(zhuǎn)移的特性，是目前乳腺癌中預(yù)后最差的一種亞型。由于內(nèi)分泌治療和針對(duì)HER-2的靶向治療對(duì)TNBC無(wú)效，至今對(duì)TNBC仍缺乏令人滿意的綜合治療方案[13]。槲皮素作為天然化合物的代表，具有良好的安全性和廣泛的抗癌譜，能夠通過(guò)改變細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。研究[14]表明，槲皮素對(duì)TNBC包括其代表細(xì)胞MDA-MB-231有良好的抑制作用?；瘜W(xué)動(dòng)力學(xué)療法是一種新興的抗腫瘤療法，具有無(wú)創(chuàng)、高效等特點(diǎn)，通過(guò)芬頓或類芬頓反應(yīng)，將腫瘤微環(huán)境中過(guò)量產(chǎn)生的H2O2轉(zhuǎn)化為更具細(xì)胞毒性的羥基自由基，從而達(dá)到抗腫瘤作用[15-18]。但由于槲皮素存在水溶性差、酶降解等問(wèn)題影響臨床應(yīng)用，所以需要對(duì)其進(jìn)行改性。形成金屬配合物是改性方法之一[8]，不僅克服了臨床應(yīng)用限制問(wèn)題，還引入了銅離子，從而引入了化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法，使其具有協(xié)同抗乳腺癌作用。

本實(shí)驗(yàn)成功制備了HCQ NP(圖1、表1及圖2)。隨后亞甲藍(lán)吸光度實(shí)驗(yàn)表明，只有在H2O2存在的情況下，HCQ NP才能產(chǎn)生羥基自由基，從而使亞甲藍(lán)的吸光度降低，而且H2O2濃度越高，產(chǎn)生羥基自由基的能力越強(qiáng)(圖3)，提示在腫瘤微環(huán)境下(與正常組織相比，具有高濃度H2O2的特點(diǎn))，可望通過(guò)化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法發(fā)揮抗腫瘤作用。TNBC具有易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，所以需要聯(lián)合療法以求最大程度的殺滅癌細(xì)胞。腫瘤微環(huán)境相比于正常組織具有高濃度H2O2[19]，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)(圖4)在模擬腫瘤微環(huán)境下，即HCQ+H2O2組具有更顯著的抗腫瘤作用。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因是在沒(méi)有H2O2存在的情況下，HCQ NP發(fā)揮抗乳腺癌作用依靠的是槲皮素的作用；而在模擬腫瘤微環(huán)境下，即H2O2存在的情況下，HCQ NP除了具有槲皮素的抗乳腺癌作用外，還具有銅離子通過(guò)觸發(fā)類芬頓反應(yīng)而發(fā)揮的化學(xué)動(dòng)力學(xué)抗乳腺癌作用。此外由于納米粒通常會(huì)在肝脾等血流豐富的器官蓄積造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)[20]，所以在研究中我們選擇了人正常肝組織細(xì)胞LO2來(lái)驗(yàn)證HCQ NP的生物相容性，而實(shí)驗(yàn)表明HCQ NP未對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生明顯的影響(圖5)，說(shuō)明HCQ NP生物相容性良好。

綜上，本研究中槲皮素作為化學(xué)治療劑和自載材料、銅離子作為連接點(diǎn)和類芬頓反應(yīng)試劑、透明質(zhì)酸作為靶向遞送載體自組裝形成的HCQ NP，具有明確的化學(xué)治療與化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療協(xié)同的抗三陰乳腺癌作用，且具有良好的生物相容性。