耿添霈 蔚慧欣 甄 攀 王軍燕

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西汾陽 032200）

汾酒釀造歷史悠久，以綿甜清香的風味著稱，是清香型白酒的典型代表。汾酒的生產(chǎn)采用豌豆和大麥制曲，高粱釀酒，清蒸二次清工藝，經(jīng)貯存勾兌而成。但是，傳統(tǒng)汾酒開放式的生產(chǎn)方式導致其酒的品質(zhì)和產(chǎn)量與整個釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化有著十分緊密的聯(lián)系。汾酒發(fā)酵過程中發(fā)酵酒醅與發(fā)酵室地缸之間的土壤（俗稱“缸花”）有著直切的接觸，汾酒在每年停產(chǎn)季節(jié)會將發(fā)酵室地缸之間的舊土換為新土，因此，對比研究汾酒發(fā)酵室新土與舊土酵母群落結(jié)構(gòu)，不僅有助于提高人們對汾酒釀造機理的認識，而且還為進一步研究汾酒微生物發(fā)酵規(guī)律，穩(wěn)定質(zhì)量，提高產(chǎn)量提供理論支撐。

本試驗利用可培養(yǎng)微生物分離方法對汾酒發(fā)酵室中的新舊土壤中酵母菌進行分離培養(yǎng)，并進行26S rDNA 序列分析，分析對比汾酒發(fā)酵室新舊土壤酵母群落結(jié)構(gòu)差異，初步建立了汾酒發(fā)酵室新舊土壤酵母群落結(jié)構(gòu)對比研究的方法以及為汾酒發(fā)酵室更換土壤提供理論依據(jù)。

近年來，以核酸為研究對象的分子生物學技術(shù)以其簡單、準確等優(yōu)點逐漸應(yīng)用到酵母菌的分類鑒定中。在rRNA 中，26SrRNA 是核糖體RNA 的一個亞基，而26S rDNA 是編碼該亞基的基因，26S rDNA 在細胞內(nèi)有數(shù)以百計的拷貝，增加了擴增的可能性。而26S rDNA 的D1/D2 區(qū)域位于大亞基的5' 端，序列長度在600 左右，目前這一區(qū)域序列多應(yīng)用于酵母菌的分類研究中。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

選取汾酒熱季停產(chǎn)階段2 個發(fā)酵室地缸間地表未更換的土壤各3 份，另選取1 份準備更換的新土壤作為對照組。

1.2 主要試劑

Marker DL2000、2×Taq PCR MasterMix、乙二胺四乙酸鈉鹽（EDTA-Na2）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、NaOH、Gelred（索萊寶）、酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、氯霉素、乙醇、乙酸、乳酸等。

1.3 主要儀器設(shè)備

ML204 電子天平，梅特勒-托利多集團；Milli Q Plus 超級純水儀，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；MAC-350P 高壓滅菌鍋，三洋電氣公司；WP750 中型機械微波爐，廣東格蘭仕電器制造有限公司；ZHJH-C1109C 超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；移液槍，艾本德股份公司；LT-36VLC8 人工氣候培養(yǎng)箱，PERCIVAL 科技公司；5417R 高速低溫離心機，艾本德股份公司；BIO-PARK 瓊脂糖水平電泳槽及電泳儀電源，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；PTC-220 PCR 儀，MJ-Research 公司；UVP Bioimaging System 凝膠電泳成像分析系統(tǒng)，美國UVP 公司；Centrifuge 5415D離心機，艾本德股份公司。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制

參考關(guān)凱樂等培養(yǎng)基配制的方法，略作修改。YPD 培養(yǎng)基的配制：酵母浸粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂20 g/L、氯霉素200 mg/L、水1 L。115 ℃條件下滅菌30 min，在超凈工作臺無菌條件下加1 mL 乙酸，2 mL 乳酸。

1.4.2 樣品處理及微生物的分離培養(yǎng)、計數(shù)、鑒定

取新舊土壤樣品20 g 于180 mL 無菌水中，充分震蕩混勻，形成10-1的菌懸液，吸取1 mL 于玻璃試管中，作為原液。在超凈工作臺內(nèi)進行10 倍梯度稀釋，依次稀釋3 個梯度，吸取100 μL 稀釋液于倒好培養(yǎng)基平皿中，每個稀釋度做3 個平行，倒置于恒溫培養(yǎng)箱，在30 ℃條件下培養(yǎng)。

接種后，每天定時觀察，待菌落長出，選擇稀釋度合適，菌落數(shù)量合適的平板，先拍照計數(shù)，再隨機選取具有形態(tài)差異的單菌落進行二次劃線得到微生物的純化條帶。

1.4.3 基因組DNA 的提取

參考吳飛等的方法，所得DNA 溶解于TE 緩沖液中，放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 26S rDNA 的PCR 擴增及測序

以酵母菌總DNA 為模板，采用真菌通用引物：引物1（NL1）：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物2（NL4）：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。PCR 反應(yīng)體系12 μL，DNA 模板2 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，無菌超純水9 μL，PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min50 s，共進35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。經(jīng)PCR 反應(yīng)擴增出26S rDNA 產(chǎn)物，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海邁譜股份有限公司進行純化測序，將得到的序列與NCBI 進行BLAST 比對，得到的同源序列和測定序列在Clustal X 軟件包中進行分析，形成一個多重序列匹配排列陣。導入MEGA4.0 軟件，采用鄰位相連（Neighbor-jioning）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 新舊土壤菌株分離比較

由此表1 可知，舊缸花中酵母菌數(shù)量顯著高于新缸花中酵母菌數(shù)量，通過梯度稀釋、平板分離培養(yǎng)計數(shù)的方法，前者分離得到了7975 株，而后者只分離到了765 株。

表1 新舊土壤菌株分離計數(shù)比較

2.2 26S rDNA 序列的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

經(jīng)過酵母菌的菌落形態(tài)及顯微鏡特征觀察，從中挑選17 株有表征差異的代表性酵母菌株，提取其DNA，利用NL1 與NL4 引物擴增目標片段后，將測序結(jié)果序列在NCBI 中用BLAST 進行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見下頁圖1。

從圖1 中可以看出，汾酒缸花中的酵母菌有Pichia、Wickerhamomyces、Saccharomycopsis、Candida 與Meyerozyma 這5 個屬。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹

在系統(tǒng)發(fā)育樹上，W1、W8、W14 菌株屬于Pichia kudriavzevii；菌株W2、W3、W4、W7、W9、W10、W11 屬于Pichia manshurica；W5 和W15 屬于Wickerhamomyces anomalus；W6 和W17 屬 于Saccharomycopsis fibuligera；W12 屬于Saccharomycopsis malanga；W13 屬于Candida aaseri；W16 菌株屬于Meyerozyma guilliermondii。其中菌株Saccharomycopsis malanga 首次在清香型白酒釀造的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)。其中絕大部分的酵母菌都在舊缸花中發(fā)現(xiàn)，而新缸花中只分離到一株P(guān).kudriavzevii 與兩株P(guān).manshurica。

3 小 結(jié)

整體來講，汾酒舊缸花中酵母菌的遺傳多樣性高于新缸花，且優(yōu)勢菌群與清香型大曲酵母菌結(jié)構(gòu)基本一致，這些菌株可能來自入缸發(fā)酵前的酒醅。值得關(guān)注的是，此次分菌并未發(fā)現(xiàn)釀酒酵母，這可能與土壤的微環(huán)境不適宜其生長有關(guān)。通過比較新舊缸花菌群差異，可以促進對廠區(qū)的釀造環(huán)境微生物多樣性的了解，為深入了解更換舊缸花是否對酒質(zhì)產(chǎn)生影響提供客觀依據(jù)。