耿添霈 蔚慧欣 甄 攀 王軍燕

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西汾陽 032200）

汾酒釀造歷史悠久，以綿甜清香的風味著稱，是清香型白酒的典型代表。汾酒的生產采用豌豆和大麥制曲，高粱釀酒，清蒸二次清工藝，經貯存勾兌而成。但是，傳統汾酒開放式的生產方式導致其酒的品質和產量與整個釀造過程中微生物群落結構變化有著十分緊密的聯系。汾酒發(fā)酵過程中發(fā)酵酒醅與發(fā)酵室地缸之間的土壤（俗稱“缸花”）有著直切的接觸，汾酒在每年停產季節(jié)會將發(fā)酵室地缸之間的舊土換為新土，因此，對比研究汾酒發(fā)酵室新土與舊土酵母群落結構，不僅有助于提高人們對汾酒釀造機理的認識，而且還為進一步研究汾酒微生物發(fā)酵規(guī)律，穩(wěn)定質量，提高產量提供理論支撐。

本試驗利用可培養(yǎng)微生物分離方法對汾酒發(fā)酵室中的新舊土壤中酵母菌進行分離培養(yǎng)，并進行26S rDNA 序列分析，分析對比汾酒發(fā)酵室新舊土壤酵母群落結構差異，初步建立了汾酒發(fā)酵室新舊土壤酵母群落結構對比研究的方法以及為汾酒發(fā)酵室更換土壤提供理論依據。

近年來，以核酸為研究對象的分子生物學技術以其簡單、準確等優(yōu)點逐漸應用到酵母菌的分類鑒定中。在rRNA 中，26SrRNA 是核糖體RNA 的一個亞基，而26S rDNA 是編碼該亞基的基因，26S rDNA 在細胞內有數以百計的拷貝，增加了擴增的可能性。而26S rDNA 的D1/D2 區(qū)域位于大亞基的5' 端，序列長度在600 左右，目前這一區(qū)域序列多應用于酵母菌的分類研究中。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

選取汾酒熱季停產階段2 個發(fā)酵室地缸間地表未更換的土壤各3 份，另選取1 份準備更換的新土壤作為對照組。

1.2 主要試劑

Marker DL2000、2×Taq PCR MasterMix、乙二胺四乙酸鈉鹽（EDTA-Na2）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、NaOH、Gelred（索萊寶）、酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、氯霉素、乙醇、乙酸、乳酸等。

1.3 主要儀器設備

ML204 電子天平，梅特勒-托利多集團；Milli Q Plus 超級純水儀，伯樂生命醫(yī)學產品有限公司；MAC-350P 高壓滅菌鍋，三洋電氣公司；WP750 中型機械微波爐，廣東格蘭仕電器制造有限公司；ZHJH-C1109C 超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；移液槍，艾本德股份公司；LT-36VLC8 人工氣候培養(yǎng)箱，PERCIVAL 科技公司；5417R 高速低溫離心機，艾本德股份公司；BIO-PARK 瓊脂糖水平電泳槽及電泳儀電源，伯樂生命醫(yī)學產品有限公司；PTC-220 PCR 儀，MJ-Research 公司；UVP Bioimaging System 凝膠電泳成像分析系統，美國UVP 公司；Centrifuge 5415D離心機，艾本德股份公司。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制

參考關凱樂等培養(yǎng)基配制的方法，略作修改。YPD 培養(yǎng)基的配制：酵母浸粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂20 g/L、氯霉素200 mg/L、水1 L。115 ℃條件下滅菌30 min，在超凈工作臺無菌條件下加1 mL 乙酸，2 mL 乳酸。

1.4.2 樣品處理及微生物的分離培養(yǎng)、計數、鑒定

取新舊土壤樣品20 g 于180 mL 無菌水中，充分震蕩混勻，形成10-1的菌懸液，吸取1 mL 于玻璃試管中，作為原液。在超凈工作臺內進行10 倍梯度稀釋，依次稀釋3 個梯度，吸取100 μL 稀釋液于倒好培養(yǎng)基平皿中，每個稀釋度做3 個平行，倒置于恒溫培養(yǎng)箱，在30 ℃條件下培養(yǎng)。

接種后，每天定時觀察，待菌落長出，選擇稀釋度合適，菌落數量合適的平板，先拍照計數，再隨機選取具有形態(tài)差異的單菌落進行二次劃線得到微生物的純化條帶。

1.4.3 基因組DNA 的提取

參考吳飛等的方法，所得DNA 溶解于TE 緩沖液中，放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 26S rDNA 的PCR 擴增及測序

以酵母菌總DNA 為模板，采用真菌通用引物：引物1（NL1）：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，引物2（NL4）：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。PCR 反應體系12 μL，DNA 模板2 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，無菌超純水9 μL，PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min50 s，共進35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。經PCR 反應擴增出26S rDNA 產物，PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海邁譜股份有限公司進行純化測序，將得到的序列與NCBI 進行BLAST 比對，得到的同源序列和測定序列在Clustal X 軟件包中進行分析，形成一個多重序列匹配排列陣。導入MEGA4.0 軟件，采用鄰位相連（Neighbor-jioning）法構建系統發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 新舊土壤菌株分離比較

由此表1 可知，舊缸花中酵母菌數量顯著高于新缸花中酵母菌數量，通過梯度稀釋、平板分離培養(yǎng)計數的方法，前者分離得到了7975 株，而后者只分離到了765 株。

表1 新舊土壤菌株分離計數比較

2.2 26S rDNA 序列的同源性分析及系統發(fā)育樹的構建

經過酵母菌的菌落形態(tài)及顯微鏡特征觀察，從中挑選17 株有表征差異的代表性酵母菌株，提取其DNA，利用NL1 與NL4 引物擴增目標片段后，將測序結果序列在NCBI 中用BLAST 進行同源性分析并構建系統發(fā)育樹，見下頁圖1。

從圖1 中可以看出，汾酒缸花中的酵母菌有Pichia、Wickerhamomyces、Saccharomycopsis、Candida 與Meyerozyma 這5 個屬。

圖1 系統發(fā)育樹

在系統發(fā)育樹上，W1、W8、W14 菌株屬于Pichia kudriavzevii；菌株W2、W3、W4、W7、W9、W10、W11 屬于Pichia manshurica；W5 和W15 屬于Wickerhamomyces anomalus；W6 和W17 屬 于Saccharomycopsis fibuligera；W12 屬于Saccharomycopsis malanga；W13 屬于Candida aaseri；W16 菌株屬于Meyerozyma guilliermondii。其中菌株Saccharomycopsis malanga 首次在清香型白酒釀造的環(huán)境中被發(fā)現。其中絕大部分的酵母菌都在舊缸花中發(fā)現，而新缸花中只分離到一株P.kudriavzevii 與兩株P.manshurica。

3 小 結

整體來講，汾酒舊缸花中酵母菌的遺傳多樣性高于新缸花，且優(yōu)勢菌群與清香型大曲酵母菌結構基本一致，這些菌株可能來自入缸發(fā)酵前的酒醅。值得關注的是，此次分菌并未發(fā)現釀酒酵母，這可能與土壤的微環(huán)境不適宜其生長有關。通過比較新舊缸花菌群差異，可以促進對廠區(qū)的釀造環(huán)境微生物多樣性的了解，為深入了解更換舊缸花是否對酒質產生影響提供客觀依據。