穆小婷 宋 佳 胡克科 別又才 陳智標(biāo)

1（清遠市農(nóng)業(yè)科技推廣服務(wù)中心，廣東清遠 511500）

2（清遠市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，廣東清遠 511500）

氟喹諾酮類（FQs）抗生素是人工合成的新型殺菌廣譜型抗菌藥物，通過抑制細菌DNA 螺旋酶，阻斷DNA 復(fù)制而產(chǎn)生抗菌作用，對G+、G-、支原體、衣原體均有很好的殺菌作用，因其高效、低毒、價格低廉等特點而被廣泛用于動物和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，尤其多應(yīng)用于治療家禽的感染性疾病。但過量使用氟喹諾酮類抗生素不僅會使生物體產(chǎn)生耐藥性，藥物殘留于畜禽體內(nèi)，而且，被食用后會累積在人體中，對成人體內(nèi)各大系統(tǒng)及中樞神經(jīng)造成不同程度的損傷，長時間食用甚至?xí)掳⒅禄?。為了有效地對動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留進行檢測和監(jiān)控，國內(nèi)外建立了多種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，常用的檢測方法有高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法，在頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，農(nóng)業(yè)部781 號公告-6-2006《雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量的測定高效液相色譜法》能夠用于檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量，但缺點是回收率太低，無法滿足當(dāng)前要求；GB/T 21312—2007《動物源性食品中14 種喹諾酮藥物殘留檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》可同時檢測雞肉和雞蛋中的喹諾酮藥物殘留，但在實際操作中提取效果并不理想，達不到檢測分析所需要求。

本文在GB/T 21312—2007《動物源性食品中14 種喹諾酮藥物殘留檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》 的基礎(chǔ)上，對標(biāo)準(zhǔn)中的提取步驟進行了優(yōu)化，并試驗了常用的8 種喹諾酮類藥物的檢測效果，以期為雞蛋中氟喹諾酮類殘留的測定提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

檸檬酸、碳酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸銨，均為分析純；甲醇、乙腈，均為色譜純；甲酸，優(yōu)級純。

HLB 固相萃取柱、電子天平（120 g/0.1mg）、漩渦混合器、高速離心機、超純水機、超聲波清洗器、固相萃取裝置。

1.2 儀器條件

離子源：電噴霧離子源（正離子掃描模式）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；霧化氣：氮氣；碰撞氣：氬氣；毛細管電壓：0.35 kv；源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流：1 000 L/Hr；錐孔氣流：30 L/Hr，駐留時間：0.028 s。其他參數(shù)如表1 所示。

表1 8 種待測物及3 種內(nèi)標(biāo)物的監(jiān)測離子對參數(shù)

1.3 樣品前處理步驟

1.3.1 提取

稱取均質(zhì)試樣5.00 g，置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入40 mL 0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，1 000 r/min 漩渦混合1 min，超聲提取10 min，-18 ℃冷凍30 min，12 000 r/min 離心10 min（4 ℃），取上清液到另一50 mL 離心管，用0.1 mol/LEDTA-Mcllvaine 緩沖溶液定容到50 mL。吸取20 mL已定容好的提取液到另一50 mL 離心管，加入20 mL正己烷，振蕩1 min，12 000 r/min 離心10 min，取下層提取液到50 mL 離心管。

1.3.2 凈化

先用6 mL 甲醇洗滌、6 mL 水活化HLB 固相萃取柱，后將提取液以2 mL/min～3 mL/min 的速度過柱。棄去濾液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液。將小柱抽干，再用6 mL 甲醇洗脫并收集洗脫液。洗脫液用氮氣吹干，1 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，1 000 r/min 漩渦混合1 min，過孔徑0.22 um濾膜，供高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

2 結(jié)果分析及討論

2.1 方法的優(yōu)化

2.1.1 提取液pH 的優(yōu)化

按GB/T 21312—2007 步驟用pH4.0 的Mcllvaine緩沖溶液進行提取時發(fā)現(xiàn)，雞肉和雞蛋的提取效果非常差，尤其雞蛋，提取離心后幾乎沒有分層，很難進行下一步試驗。根據(jù)氟喹諾酮類的化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，多數(shù)氟喹諾酮類在C-3 處含有羧基，C-7 處連有哌嗪等含氮堿性基團，屬于酸堿兩性化合物，其酸解離常數(shù)pKa=5.5～6.6，堿解離常數(shù)pKa=7.2～8.9，等電點pKI≈7。鑒于此，本試驗將Mcllvaine 緩沖溶液的pH 調(diào)節(jié)為7.0，試驗結(jié)果顯示，提取后出現(xiàn)明顯的分層，因此本試驗將Mcllvaine 緩沖溶液的pH 調(diào)節(jié)為7.0。

2.1.2 添加正己烷除脂

GB/T 21312—2007 中離心結(jié)束后直接取上清液過柱，可實際試驗發(fā)現(xiàn)，因離心時分層效果并不理想，尤其雞蛋的油脂含量高，很難取到上清液，雖然經(jīng)過提取液pH 的改良，分層效果好很多，但除脂效果還是不理想。因此，考慮加入正己烷除脂。試驗采用上清液和正己烷1∶1 除脂，分取20 mL上清液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)離心后上清液很清澈，回收率也良好，與楊嘉偉試驗結(jié)果有所不同，而與楊朝琳的試驗結(jié)果相統(tǒng)一。考慮到分取體積太少增大誤差，本試驗最終確定分取體積20 mL，加入正己烷20 mL 進行除脂。

2.1.3 雞肉雞蛋合并提取

GB/T 21312—2007 中雞肉和雞蛋的提取液是同一種，但提取次數(shù)及提取液體積不同。雞肉提取步驟為加入20 mL 0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，提取3 次，合并上清液。雞蛋提取步驟為加入40 mL 0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取1 次。在實際試驗過程中，大部分情況都是批量試驗，且雞肉雞蛋同一批次做，因此，本試驗研究如何將二者的提取步驟統(tǒng)一。經(jīng)反復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，雞肉雞蛋均加入 40 mL 0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 緩沖液提取，提取后將提取液轉(zhuǎn)入另一離心管后用0.1 moL/L EDTA-Mcllvaine 緩沖液定容至50 mL，這樣提取其結(jié)果回收率并不低于原步驟，且比原步驟簡單易操作。

本試驗在離心前增加冷凍處理30 min 的步驟。因少部分樣品脂肪含量太高，經(jīng)過前面的優(yōu)化還是不能很好的分層，因此本試驗對冷凍處理和熱處理進行對比，即將樣品放在冰箱中冷凍30 min，或在水浴鍋中進行熱沉淀，之后再進行離心提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分層效果不好的樣品經(jīng)過冷凍30 min 處理即可得到解決。在實際操作中，若經(jīng)過前面處理步驟可以得到很好的上清液則不需要進行此步驟。另外，試驗采用性質(zhì)相似的同位素內(nèi)標(biāo)法進行測量，有效降低了前處理過程中的操作誤差和其他條件導(dǎo)致的不統(tǒng)一及基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的影響。圖1～圖11為雞蛋中待測物及內(nèi)標(biāo)物的定性定量離子色譜圖。

圖1 氧氟沙星定性定量離子色譜圖

圖2 洛美沙星定性定量離子色譜圖

圖3 培氟沙星定性定量離子色譜圖

圖4 諾氟沙星定性定量離子色譜圖

圖5 恩諾沙星定性定量離子色譜圖

圖6 環(huán)丙沙星定性定量離子色譜圖

圖7 達氟沙星定性定量離子色譜圖

圖8 沙拉沙星定性定量離子色譜圖

圖9 恩諾沙星-D5 離子色譜圖

圖10 環(huán)丙沙星-D8 離子色譜圖

圖11 諾氟沙星-D5 離子色譜圖

2.2 方法學(xué)論證

2.2.1 校準(zhǔn)曲線和線性范圍

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用初始流動相（甲醇-乙腈溶液：0.2%甲酸水溶液=1∶9）逐級稀釋成5.0 ng/mL～100.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。平行稱取雞蛋陰性樣品5.00 g，分別置于6 支50 mL 聚丙烯離心管中，加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液1.0 mL，最終形成5.0 ng/mL（1.0 μg/kg）、10.0 ng/mL（2.0 μg/kg）、25.0 ng/mL（5.0 μg/kg）、50.0 ng/mL（10.0 μg/kg）、75.0 ng/mL（15.0 μg/kg）、100.0 ng/mL（20.0 μg/kg）6 個標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按以上優(yōu)化后的步驟進行提取和凈化。以所得的8 種氟喹諾酮類藥物的離子峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2 為回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.2.2 檢出限和定量限

雞蛋中氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、沙拉沙星8 種檢測指標(biāo)在GB/T 21312—2007 中檢出限分別為0.5 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、1.0 μg/kg、0.5 μg/kg、1.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg，定量限分別為2 μg/kg、2 μg/kg、3 μg/kg、3 μg/kg、2 μg/kg、4 μg/kg、2 μg/kg、3 μg/kg。本試驗以標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低點，取信噪比為S/N=3，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算得出檢出限；以標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低點，取信噪比為S/N=10，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算得出定量限，試驗結(jié)果如表2 所示。8 種氟喹諾酮類藥物的方法檢出限在0.001 μg/kg～0.009μg/kg 范圍內(nèi)，定量限在0.003 μg/kg～0.031 μg/kg范圍內(nèi)，均達到了國家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求。

2.2.3 準(zhǔn)確度和精密度

稱取5.00 g 陰性雞蛋樣品，以GB/T 21312—2007 中方法測定低限為基礎(chǔ)，以GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》附錄F中檢測方法確認的技術(shù)要求為試驗依據(jù)，在方法測定低限（1.0 μg/kg）、2 倍方法測定低限（2.0 μg/kg）、10 倍方法測定低限（10.0 μg/kg）進行三水平試驗，按本文優(yōu)化后的方法進行前處理。8 種氟喹諾酮類藥物的平均回收率為81.60%～103.88%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.78%～9.91%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均可達到國家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)指標(biāo)要求，具體結(jié)果見表2。

表2 雞蛋中8 種待測物線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率及精密度(n=6)

3 結(jié)論

本試驗對GB/T 21312—2007《動物源性食品中14 種喹諾酮藥物殘留檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中部分步驟進行優(yōu)化，結(jié)果表明，優(yōu)化后的方法靈敏度更高，重現(xiàn)性更好，能夠滿足雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留的例行檢測。另外，因篇幅有限，文章只提供了針對雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留檢測相關(guān)數(shù)據(jù)，事實上，此方法針對雞肉中的8 種氟喹諾酮類殘留量檢測同樣適用，且回收率和靈敏度均可達到國家標(biāo)準(zhǔn)要求。文章旨在為防范非法添加氟喹諾酮類藥物殘留提供技術(shù)依據(jù)。