饒小惠

（大埔縣人民醫(yī)院，廣東 梅州 514229）

感染性腹瀉是臨床常見(jiàn)的腹瀉類型，具有較高的發(fā)病率與流行性，其中沙門(mén)菌和志賀菌是感染性腹瀉發(fā)生的重要腸道致病菌[1]。臨床發(fā)現(xiàn)，及時(shí)確定腸道致病菌類型對(duì)于疾病治療和康復(fù)具有重要的臨床意義。目前臨床對(duì)于腹瀉患者多采用常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測(cè)，雖具有一定的效果，但是存在操作步驟復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。而隨著醫(yī)療科技的不斷完善，發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR 法通過(guò)檢測(cè)沙門(mén)菌和志賀菌DNA 來(lái)檢測(cè)腹瀉感染也可取得理想的檢查效果。但是目前臨床對(duì)于熒光定量PCR 法和常規(guī)細(xì)菌鑒定法對(duì)腸道病原菌（沙門(mén)菌和志賀菌）的陽(yáng)性檢出符合率是否統(tǒng)一尚未明確[2]。鑒于此，本文將60 例患者進(jìn)行分析，總結(jié)熒光定量PCR 法與常規(guī)細(xì)菌鑒定法的方法，試探討其患者腸道致病菌檢測(cè)的影響，詳細(xì)報(bào)告內(nèi)容請(qǐng)看下文。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究例數(shù)有60 例，研究時(shí)間在2020年1月-2020年12月，研究對(duì)象是腹瀉患者，60 例患者中男女的比例為33:27；患者年齡主要集中在6 個(gè)月-68 歲，平均（34.56±10.24）歲。對(duì)比分析患者的各項(xiàng)資料，具有可比性（P＞0.05）

納入標(biāo)準(zhǔn)：①60 例患者經(jīng)臨床檢查確診為腹瀉；②患者神志清醒，能夠進(jìn)行簡(jiǎn)單的交流，可以配合完成檢測(cè)；③患者及家屬簽字同意參加研究，并且獲取醫(yī)學(xué)委員會(huì)的審核通過(guò)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者的心肝腎等器官存在嚴(yán)重器質(zhì)性病變；②患者并發(fā)嚴(yán)重全身感染；③患者的精神異常，不能正常交流，無(wú)法配合完成檢查；④患者的病歷資料不齊全或者不愿參加研究。

1.2 方法

①60 例患者展開(kāi)常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測(cè)，具體檢測(cè)方法為：訩標(biāo)本采集：患兒入院后，護(hù)士告知家屬糞便收集方法，并為家屬發(fā)放糞便收集器，采用5 支無(wú)菌棉擦拭多點(diǎn)采集糞便標(biāo)本，采集完新鮮的大便標(biāo)本后，立即將其置入無(wú)菌盒中，并送往檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測(cè)。訪檢測(cè)方法：培養(yǎng)溫度設(shè)置為35oC，培養(yǎng)時(shí)間大約為18-24 小時(shí)，之后采用劃線的方法接種到SS瓊脂、XLD 瓊脂，并在平板培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的溫度保持在37oC，仔細(xì)觀察致病菌的顏色變化情況，對(duì)于少數(shù)可疑病菌，可將其進(jìn)行涂片和染色處理后進(jìn)行固定制片，采用顯微鏡進(jìn)行觀察，必要時(shí)可進(jìn)行血清血凝集試驗(yàn)，直至鑒定出致病菌。②60 例患者展開(kāi)熒光定量PCR 法檢測(cè)，詳細(xì)檢測(cè)過(guò)程為：訩采用一次性多功能采樣器收集患者的肛拭子，將收集的標(biāo)本放入沙門(mén)菌-志賀菌增菌液中進(jìn)行增菌，增菌時(shí)間在3 個(gè)小時(shí)到5 個(gè)小時(shí)；訪使用一次性滴管吸入增菌液，并在1.5ml 的無(wú)菌離心管中滴入2 滴增菌液，將20 人份的肛拭子增菌液置入同一個(gè)1.5ml 的無(wú)菌離心管中，然后進(jìn)行離心分離，離心速度設(shè)為每分鐘10000r，離心時(shí)間為3 分鐘，離心分離結(jié)束后去掉上清，并保留50μl 的低層液；訫在試管中加入50ml 的DNA 提取液，等到液體沉淀懸浮后開(kāi)大火進(jìn)行煎煮，溫度設(shè)為100oC，煎煮時(shí)間為5 分鐘，然后進(jìn)行二次離心分離，離心時(shí)間為3 分鐘，離心速度為每分鐘10000r，之后將5μl 上清液滴入滅菌離心管中；④選擇濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司生產(chǎn)的熒光定量PCR 儀（型號(hào)為：CFX Connect）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系設(shè)為25μl；檢測(cè)途徑：沙門(mén)菌FAM，志賀菌VIC；循環(huán)參數(shù)設(shè)為：每3 分鐘94℃作為一個(gè)循環(huán)；每30秒93℃至每45 秒55℃為44 個(gè)循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo)

比較熒光定量PCR 法與常規(guī)細(xì)菌鑒定法的檢測(cè)結(jié)果，仔細(xì)記錄兩種方法中沙門(mén)菌和志賀菌的例數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究所得數(shù)據(jù)均錄入至Excel 2010 中予以校對(duì)，采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理。百分比（%）表示計(jì)數(shù)資料，計(jì)數(shù)資料用卡方（χ2）檢驗(yàn)。P評(píng)定檢驗(yàn)結(jié)果，P＞0.05 提示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05 提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 評(píng)價(jià)分析兩種檢測(cè)方法在沙門(mén)菌陽(yáng)性率的差異

從表1 的結(jié)果能夠看出，在沙門(mén)菌陽(yáng)性率上，熒光定量PCR 法為8.33%，常規(guī)細(xì)菌鑒定法為5.00%，熒光定量PCR法略高于常規(guī)細(xì)菌鑒定法，差異不大（P＞0.05）。

表1 評(píng)價(jià)分析兩種檢測(cè)方法在沙門(mén)菌陽(yáng)性率的差異[n(%)]

2.2 評(píng)價(jià)分析兩種檢測(cè)方法在志賀菌陽(yáng)性率的差異

從表2 的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR 法檢測(cè)的志賀菌陽(yáng)性率為6.67%，常規(guī)細(xì)菌鑒定法檢測(cè)的志賀菌陽(yáng)性率為3.33%，熒光定量PCR 法略高于常規(guī)細(xì)菌鑒定法，比較差異不大（P＞0.05）。

表2 評(píng)價(jià)分析兩種檢測(cè)方法在志賀菌陽(yáng)性率的差異[n(%)]

3 討論

腹瀉是臨床上比較常見(jiàn)的疾病，也是患者營(yíng)養(yǎng)不良的影響因素，不利于患者的正常生長(zhǎng)發(fā)育。腹瀉主要是指由多種病因引起的以腹瀉為主的一類疾病，具有病因多樣、流行范圍廣、缺乏有效預(yù)防措施的特點(diǎn)，5 歲以下的兒童是該疾病的主要發(fā)病人群，臨床上主要表現(xiàn)為腹痛、大便次數(shù)增多、發(fā)熱等癥狀，給患者的日常生活帶來(lái)不良影響[3]?；颊甙l(fā)生腹瀉后，若是沒(méi)有及時(shí)采取有效、正確的治療措施，可能會(huì)對(duì)患者的生命安全構(gòu)成威脅，已經(jīng)是造成發(fā)展中國(guó)家嬰幼兒死亡的重要原因之一，成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)社會(huì)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及人們的生活、工作產(chǎn)生巨大的損害[4]。腸道感染是腹瀉發(fā)生的重要原因，而沙門(mén)菌和志賀菌是臨床比較常見(jiàn)的腸道致病菌，其中沙門(mén)菌是寄生在人類腸道內(nèi)生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭陰性桿菌；而志賀菌又被成為痢疾桿菌，是人類細(xì)菌性痢疾的病原菌，可在人與人之間廣泛傳染[5]。沙門(mén)菌與志賀菌主要是由于食用受到污染的食物或者飲用受到污染的水源引起的，具有傳染性[6]。因此，選擇合理有效的診斷方式對(duì)于疾病的防治具有重要的意義。

常規(guī)細(xì)菌鑒定法是臨床檢測(cè)沙門(mén)菌和志賀菌的常用方法，其通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清檢測(cè)等進(jìn)行鑒別診斷，可有效檢測(cè)出沙門(mén)菌和志賀菌；但是，常規(guī)細(xì)菌鑒定法的檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，獲取檢測(cè)報(bào)告的等待時(shí)間長(zhǎng)，需要用到的試劑比較多，對(duì)檢驗(yàn)科人員的技術(shù)要求極高，且受到外界因素的影響較大，限制了臨床應(yīng)用范圍[7]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展與完善，熒光定量PCR 法逐漸用于微生物的鑒別診斷中，取得了較好的檢測(cè)效果，目前已在感染性疾病中廣泛應(yīng)用[8]。熒光定量PCR 法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，利用一段DNA 為模板，在DNA 聚合酶和核苷酸底物作用下，將該段DNA 擴(kuò)張至足夠數(shù)量，以便進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析[9]。相較于常規(guī)細(xì)菌鑒定法，熒光定量PCR 法將20 人份的樣品合成一個(gè)上機(jī)樣品，降低了成本，使得價(jià)格能夠?yàn)榛颊咚邮?。本次研究發(fā)現(xiàn)，在沙門(mén)菌陽(yáng)性率和志賀菌陽(yáng)性率上，多重?zé)晒舛縋CR 法略高于常規(guī)細(xì)菌鑒定法（P＞0.05），這與李芬[10]的研究報(bào)告結(jié)果較為一致，說(shuō)明采用熒光定量PCR 法檢測(cè)腸道致病菌的效果顯著，且安全可靠。

綜上所述，多重?zé)晒舛縋CR 法用于腸道致病菌檢測(cè)的效果理想，可以快速檢測(cè)出腸道致病菌類型，為疾病診斷和治療提供了依據(jù)，具有較好的臨床推廣意義。