左文娜，朱虹，金愛燕，王強，王洪琴

喉癌是喉黏膜上皮組織的惡性腫瘤，是頭部常見的惡性腫瘤之一。臨床主要表現(xiàn)為聲音嘶啞，咽喉異物感，咽下疼痛，痰中帶血，伴有刺激性咳嗽，病情嚴重會導致呼吸困難等[1]。該病多發(fā)于老年男性，中國喉癌的發(fā)病率約為5.83/10萬，占全身腫瘤的2%左右[2]。隨著環(huán)境污染的加重，喉癌的發(fā)病率逐漸升高。該病的發(fā)病機制尚不明確，一般與吸煙、口腔衛(wèi)生欠佳、接觸有害粉塵、內分泌失調、病毒和維生素D代謝失常關系密切[3]。喉癌的發(fā)生不限于侵襲、遷移、轉移和血管生成，而且還與細胞外環(huán)境密切相關[4]?；|金屬蛋白酶-9(MMP-9)在細胞外基質膜蛋白裂解和重構中發(fā)揮著非常重要的作用，與癌癥的病理學特性廣泛相關[5]。相關研究表明，MMP-9在腫瘤的轉移、侵襲和血管生成中起著重要的作用，并且介導腫瘤的微環(huán)境變化，在大多數(shù)情況下促進腫瘤的發(fā)展[6]。另外，MMP-9還與心血管疾病和免疫疾病相關。磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路調控腫瘤細胞的多種功能，如細胞生長、增殖、遷移和凋亡等[7]。目前關于沉默MMP-9調控PI3K/Akt磷酸化水平的機制尚不清楚，現(xiàn)觀察沉默MMP-9對喉癌細胞侵襲、遷移及PI3K/Akt磷酸化水平的影響，為臨床喉癌治療提供一定的參考，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 (1)實驗對象：收集2018年3月—2019年3月河北省滄州市中心醫(yī)院耳鼻喉科診治喉癌患者20例的術后癌組織和癌旁組織(于-80℃冰箱中保存)。人鼻咽永生化上皮細胞：NP69、HEp2、TU212 、TU686、TU177細胞(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。(2)試劑：甲醛、含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000轉染試劑(南通碧云天生物技術研究所)；四甲基偶氮唑鹽(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Trizol裂解液、蛋白裂解液(南京建成生物工程研究所)；qRT-PCR試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。(3)儀器設備：酶標儀(德國biosys bioreader)、流式細胞儀(美國BD公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀)、Transwell小室(北京達科為生物技術有限公司 ，3422)、圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus 7.0)、顯微鏡(日本Olympus公司，CX23)。

1.2 實驗方法 取NP69、HEp2、TU212、TU686、TU177細胞分別維持在DMEM與10%FBS的培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，2 d更換液體1次，待細胞處于對數(shù)生長期時，采用適量胰酶消化，吸出培養(yǎng)液，進行傳代培養(yǎng)，待后期實驗備用。待HEp2細胞生長密度達到80%以上，取之進行轉染，轉染siRNA Control 40 nmol/L為siRNA Control組，轉染pGV 102-MMP-9-siRNA 40 nmol/L為MMP-9 siRNA組，按Lipofectamine 3000轉染試劑說明書進行轉染，只進行換液處理，沒有轉染的HEp2細胞記為Control組。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測MMP-9 mRNA表達：將喉癌組織和癌旁組織放入液氮中研磨，在喉癌組織、癌旁組織呈粉狀時加入Trizol裂解液1 ml，提取組織中的RNA，并檢測純度和濃度，逆轉錄成cDNA，采用qRT-PCR試劑盒檢測MMP-9 mRNA水平。為了驗證MMP-9 mRNA在NP69、HEp2、TU212、TU686、TU177細胞的表達，也分別加入Trizol裂解液1 ml，提取細胞中的RNA，檢測純度和濃度，逆轉錄成cDNA，MMP-9 mRNA引物：上游5'-ACTTCATCACCATTCCAT-3',下游5'-GCTTCTTATCAACACT-3'；GAPDH內參，上游5'-CAATTCTCCATTCTCATT-3',下游5'-CATATCCTATAATCCA-3',反應條件為92℃、30 min， 80℃退火10 s，70 ℃延伸15 s，45個循環(huán)，采用2-ΔΔCT計算相對含量。

1.3.2 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測HEp2細胞增殖： 將Control組、siRNA Control組和MMP-9 siRNA組轉染后的HEp2細胞以1.0×104個/孔接種到24孔板中，細胞培養(yǎng)過夜，在24 h、48 h、72 h、96 h，采用 MTT法測定細胞增殖情況，酶標儀在490 nm下完成吸光度值(OD)測定。

1.3.3 流式細胞術實驗檢測HEp2細胞凋亡：取各組轉染后的HEp2細胞，以每孔1×106個/孔接種于24孔板中，將熒光標記的 Annexin V加到細胞懸液中，常溫孵育20 min，采用PI染色，應用流式細胞儀進行檢測，實驗重復3次。

1.3.4 Transwell實驗檢測HEp2細胞侵襲：將各組轉染后的HEp2細胞，以2 ×104個/孔接種無血清培養(yǎng)基的Transwell小室中進行細胞侵襲實驗，再將含10% FBS 的培養(yǎng)基放入Transwell小室中，孵育48 h后，使用甲醛固定，采用0.1%結晶紫染色30 min，拍照，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)計數(shù)細胞侵襲的數(shù)量。

1.3.5 傷口愈合實驗檢測HEp2細胞遷移：將各組轉染后的HEp2細胞以1 ×105個/孔放入6孔板中，室溫孵育12 h，觀察細胞生長情況，當細胞的融合度達到80%時，采用200 μl移液槍頭刮細胞表面，使其形成傷口，顯微鏡拍照，使用Image J圖像處理軟件計算遷移面積，傷口愈合率=[(0 h面積-48 h面積) /0 h 面積]×100%。

1.3.6 蛋白質印跡(Western-blot)法分析檢測PI3K/Akt磷酸化水平：取各組轉染后的HEp2細胞，加入蛋白裂解液，并收集裂解后的液體離心處理，取上清液，采用BCA法定量，提取總蛋白，進行 SDS-PAGE電泳、轉膜，再加入5%胎牛血清蛋白封閉60 min，加入相應的一抗，4 ℃孵育12 h，洗膜后加入二抗，室溫孵育60 min后，TBST洗膜，采用化學發(fā)光法檢測p-PI3K、p-Akt、PI3K和Akt蛋白水平，拍照后應用Gel-Pro analyzer軟件分析灰度值。

2 結 果

2.1 MMP-9在喉癌組織、癌旁組織和人鼻咽永生化上皮細胞中的表達比較 qRT-PCR 檢測結果顯示，喉癌組織中MMP-9 mRNA表達明顯高于癌旁組織(1.56±0.41 vs. 0.24±0.07,t/P=11.237/0.001)；鼻咽永生化上皮細胞NP69與HEp2、TU212、TU686、TU717細胞中MMP-9 mRNA表達水平分別為0.32±0.05、1.83±0.46、1.36±0.27、1.33±0.25、1.51±0.32，與鼻咽永生化上皮細胞NP69比較，HEp2、TU212、TU686、TU177細胞中MMP-9 mRNA表達明顯升高(t/P=8.673/0.009、6.431/0.017、6.159/0.022、6.873/0.011)，且HEp2細胞中MMP-9 mRNA表達最高，故后續(xù)采用HEp2細胞進行實驗。

2.2 沉默MMP-9對喉癌細胞增殖和凋亡作用的影響 MTT法檢測結果顯示，Control組24 h、48 h、72 h和96 h的HEp2細胞增殖能力分別為0.26±0.05、0.48±0.07、0.83±0.09、1.26±0.13，siRNA Control組24 h、48 h、72 h和96 h的HEp2細胞增殖能力分別為0.24±0.06、0.46±0.06、0.82±0.07、1.19±0.11，MMP-9 siRNA Control組24 h、48 h、72 h和96 h的HEp2細胞增殖能力分別為0.24±0.07、0.44±0.08、0.51±0.06、0.69±0.07。與Control組比較，siRNA Control組各時點HEp2細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(t/P=0.795/0.274、0.831/0.213、 0.949/0.195、0.982/0.154)；與siRNA Control組比較，MMP-9 siRNA組24 h、48 h細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(t/P=1.036 /0.116、1.227/0.109),而72 h和96 h細胞增殖能力顯著降低(t/P=5.382/0.005、5.146/0.007)。流式細胞術實驗檢測結果顯示，與Control組比較，siRNA Control組HEp2細胞凋亡能力差異無統(tǒng)計學意義(t/P=1.156/0.785); MMP-9 siRNA組HEp2細胞凋亡能力明顯高于Control組和siRNA Control組(t/P=8.643/0.001、8.237/0.001)，見圖1。

注：與Control組比較，aP<0.01

2.3 沉默MMP-9對喉癌細胞侵襲作用的影響 Transwell實驗檢測結果顯示，與Control組比較，siRNA Control組HEp2細胞侵襲能力差異無統(tǒng)計學意義(t/P=1.379/0.483)； MMP-9 siRNA組HEp2細胞侵襲能力顯著低于Control組和siRNA Control組(t/P=7.673/0.001、6.792/0.002)，見圖2。

注：與Control組比較，aP<0.01

2.4 沉默MMP-9對喉癌細胞遷移作用的影響 傷口愈合實驗檢測結果顯示，與Control組比較，siRNA Control組HEp2細胞愈合率差異無統(tǒng)計學意義(t/P=1.756/0.336)； MMP-9 siRNA組HEp2細胞愈合度顯著低于Control組和siRNA Control組(t/P=6.882/0.003、6.513/0.005)，見圖3。

注：與Control組比較，aP<0.01

2.5 沉默MMP-9對PI3K/Akt蛋白磷酸化水平的影響 Western-blot分析檢測結果顯示， Control組、siRNA Control組和MMP-9 siRNA組中PI3K、Akt蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Control組、siRNA Control組中p-PI3K和p-Akt蛋白水平比較差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；MMP-9 siRNA組中p-PI3K和p-Akt蛋白水平顯著低于Control組和siRNA Control組(t/P=9.459/0.001、8.736/0.001、6.873/0.001、6.694/0.001)，見圖4。

注：與Control組比較，aP<0.01

3 討 論

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，以喉鱗癌為主要類型，近年來，喉癌的發(fā)病率逐漸增高。全切除術是一種傳統(tǒng)的喉癌治療方法，可顯著減少該病的復發(fā)情況，但可能引起喉部功能喪失[8]。放化療已經廣泛應用于喉癌的治療，盡管可以延長患者的生存時間，但總體的治療效果并不理想，預后不良，生存率低，后遺癥和并發(fā)癥較多，嚴重影響了患者的生命及生活質量[9]。所以亟需深入了解喉癌的發(fā)生和發(fā)展機制，尋找新的治療策略提高喉癌的診治和預后水平。

腫瘤細胞穿透基底膜的過程中，基質金屬蛋白酶(MMPs)發(fā)揮著重要的作用，它能夠降解細胞外基質從而形成腫瘤侵襲與轉移的通道[10]。MMP-9與腫瘤的關系尤其密切，MMP-9基因位于染色體20q13.12，MMP-9蛋白含有催化結構域、血凝素樣結構域、鉸鏈結構域、信號肽和前肽結構[11-12]。MMP-9具有蛋白水解裂解活性，在細胞外環(huán)境中參與許多生物學過程，促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展[13]。MMP-9在腫瘤侵襲和轉移過程中也起到重要的作用，相關研究表明，miR-188-5p通過MMP-9表達而抑制瘢痕疙瘩的增殖和侵襲[14]。本研究通過qRT-PCR 檢測MMP-9在喉癌組織和喉癌細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)喉癌組織中MMP-9 mRNA表達明顯高于癌旁組織，與鼻咽永生化上皮細胞NP69比較，HEp2、TU212、TU686、TU177細胞中MMP-9 mRNA表達明顯升高，證明了MMP-9在喉癌組織和喉癌細胞中高表達，具有促進腫瘤發(fā)展的作用。

本結果表明，沉默MMP-9的HEp2細胞增殖、侵襲能力明顯降低，細胞愈合度也明顯減少，從而說明抑制MMP-9能夠抑制HEp2細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡。相關研究表明，沉默MMP-9能夠抑制乳腺癌腫瘤細胞的生長、遷移及侵襲[15]，與本結論相類似。MMP-9能夠降解血管基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，從而參與腫瘤細胞的侵襲和遷移，同時能夠促進血管內皮生長因子來調節(jié)腫瘤血管的發(fā)生，因此沉默MMP-9可抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移，從而抑制腫瘤血管的發(fā)生。

PI3K是具有催化活性的信號蛋白，與下游的AkT結合發(fā)生磷酸化，構成PI3K/Akt信號通路，該通路在細胞遷移過程中發(fā)揮著重要的作用[16-17]。相關研究發(fā)現(xiàn)，MMPs表達呈PI3K依賴的特點，即激活PI3K會使MMPs的表達水平上調，抑制PI3K會使MMPs的表達水平下調[18]。本結果顯示，沉默MMP-9 的表達，p-PI3K和p-Akt蛋白水平明顯低于Control組和siRNA Control組。由此推測，沉默MMP-9可通過抑制PI3K/Akt信號通路，阻止細胞外基質的降解，來減緩喉癌的發(fā)展。

綜上所述，沉默MMP-9對喉癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響，并闡述了與PI3K/Akt蛋白磷酸化水平的關系，為喉癌的診斷和治療研究提供了一定的理論基礎。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

左文娜：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；朱虹：進行統(tǒng)計學分析;金愛燕：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;王強：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;王洪琴：課題設計，論文撰寫