孟婷婷綜述 李鐵剛審校

百草枯(paraquat,PQ)，又名對草快、克蕪蹤，化學(xué)名稱為1，1-二甲基-4，4-聯(lián)吡啶陽離子鹽，是一種聯(lián)吡啶類除草劑。由于其價格低廉，使用方便，已在世界范圍內(nèi)廣泛使用，同時也成為發(fā)展中國家常見的農(nóng)藥中毒致死原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，百草枯中毒致死率高達(dá)50%～70%[1]。百草枯可通過消化道、呼吸道、皮膚吸收而致多器官損傷，但尤以肺損傷為主。一些學(xué)者認(rèn)為百草枯與肺內(nèi)二胺和腐胺、精胺、亞精胺等多胺的結(jié)構(gòu)相似，從而導(dǎo)致肺競爭性地積累百草枯[2]。中毒者可出現(xiàn)致死性肺出血、水腫，經(jīng)過搶救度過急性期的患者大多數(shù)也會發(fā)生不可逆性的肺纖維化、增生等改變；此外還可致肝、腎損害，同時累及循環(huán)、神經(jīng)、血液、泌尿等系統(tǒng)[3]。由于沒有特效解毒藥，百草枯中毒預(yù)后很差。本文對近年來有關(guān)百草枯中毒的研究及長鏈非編碼RNA在百草枯治療中的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 非編碼RNA定義

人類基因組研究計(jì)劃成果認(rèn)為，人類30多億個堿基對的基因序列中2/3序列被反轉(zhuǎn)錄，而最終僅有不到2%核酸序列用于編碼蛋白，大部分基因不表達(dá)蛋白質(zhì)，這一類基因被稱為非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)。過去非編碼RNA被認(rèn)為是垃圾RNA，但隨著研究深入，非編碼RNA作為影響基因表達(dá)因素而逐漸被重視[4]。非編碼RNA通常指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，但這并不意味著這種RNA既不包含信息也不具有功能。隨著高通量測序技術(shù)的突飛猛進(jìn)，非編碼RNA的研究也逐漸深入，這些RNA似乎包含一個隱藏的內(nèi)部信號層。這些內(nèi)部信號層控制著生理和發(fā)育中不同水平的基因表達(dá)，包括染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、表觀遺傳記憶、轉(zhuǎn)錄、RNA剪接、編輯、翻譯和翻轉(zhuǎn)。人們意識到非編碼RNA可以通過其穩(wěn)定的二級或三級結(jié)構(gòu)發(fā)揮多種生物學(xué)功能。非編碼RNA 根據(jù)長度可劃分為3類：<50 nt，包括microRNA、siRNA、piRNA；50～500 nt，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA 等；>500 nt，包括長的mRNA-like非編碼RNA、長的不帶polyA 尾巴的非編碼RNA等。但目前的研究熱點(diǎn)是具有調(diào)節(jié)功能的RNA，主要是miRNA、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。許多非編碼RNA多聚腺苷化后大部分仍會保留在核內(nèi)，少數(shù)會被運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)。胞內(nèi)的miRNA和lncRNA分別與mRNA和miRNA的3’端非翻譯區(qū)的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而影響RNA的降解或者翻譯過程，導(dǎo)致靶細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)病理生理變化。

2 百草枯中毒機(jī)制

百草枯中毒機(jī)制尚未完全清楚，目前研究比較廣的主要有以下幾個學(xué)說：氧自由基產(chǎn)生學(xué)說、線粒體損傷學(xué)說、分子生物學(xué)說和酶失衡學(xué)說。這些學(xué)說都源于微粒體起源理論、線粒體起源理論[3]，即百草枯在含有肝微粒體和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)生成系統(tǒng)的孵育混合物生物轉(zhuǎn)化過程中形成了羥基自由基，而線粒體是百草枯自由基形成的場所和靶點(diǎn)。眾多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，百草枯所致的細(xì)胞損傷最初表現(xiàn)為線粒體腫脹，隨后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞變性和細(xì)胞質(zhì)水腫。自由基的強(qiáng)氧化性、氧化還原酶系的失衡損傷細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和功能、細(xì)胞內(nèi)的能量、物質(zhì)代謝系統(tǒng)障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞水腫、凋亡，加重組織炎性反應(yīng)。而長鏈非編碼RNA在百草枯中毒機(jī)制中通過其競爭性的結(jié)合mRNA，減弱miRNA對細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，間接調(diào)控mRNA，而發(fā)揮著增強(qiáng)或減弱線粒體的損傷和胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生。

3 百草枯中毒肺損傷機(jī)制

百草枯中毒的動物實(shí)驗(yàn)和臨床病例分析均已證明百草枯主要積聚在肺部，即使治療后血液中的百草枯濃度降低，但肺內(nèi)百草枯水平卻無任何變化[3]。該效應(yīng)可用肺內(nèi)多胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)解釋，該轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在肺泡Ⅰ型、Ⅱ型細(xì)胞膜上大量表達(dá)。百草枯在肺內(nèi)易聚集，不易消除的特點(diǎn)，使得肺成為百草枯對人體損害的首要靶器官。研究證實(shí)，上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制、炎性因子的介導(dǎo)和氧化應(yīng)激在百草枯致肺損傷中發(fā)揮重要作用。

3.1 上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT) EMT指上皮細(xì)胞從形態(tài)學(xué)上到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，它賦予了細(xì)胞侵襲和遷移的能力。EMT被認(rèn)為是腫瘤形成和器官纖維化形成中的重要步驟。Yamada等[5]證實(shí)EMT在百草枯致肺纖維化中也起著重要作用。肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞主要由肺泡上皮細(xì)胞通過EMT而來，表現(xiàn)為上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)降低，而纖維化相關(guān)基因基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白的mRNA水平升高[5-6]。除此之外，細(xì)胞因子在EMT形成過程中也扮演著重要角色。研究已經(jīng)證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)激活TGF-β/Smad信號通路[7-8]；缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF1α)調(diào) 控 Snail和 β-catenin信號通路[9-10]；HIF1α調(diào)節(jié) LOX/β-catenin的表達(dá)[11]；結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)均參與了EMT和早期肺纖維化的形成過程[12]。

3.2 炎性介質(zhì) 參與和介導(dǎo)炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子稱為炎性介質(zhì)。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，炎性介質(zhì)可參與腫瘤形成、血液病發(fā)展、器官纖維化過程。百草枯可激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌細(xì)胞因子，參與肺纖維化過程。研究已經(jīng)證實(shí)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)、白介素1β(IL-1β)和IL-6的表達(dá)水平，在百草枯所致的急性肺損傷中明顯升高[13]。

3.3 氧化應(yīng)激 對百草枯中毒機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，百草枯在被人體吸收進(jìn)入血液循環(huán)后，經(jīng)歷了氧化還原循環(huán)的交替還原和再氧化過程，并在氧化還原循環(huán)過程中起到催化作用，生成負(fù)氧離子，然后引發(fā)一個級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致其他活性氧物種(ROS)的產(chǎn)生，主要是過氧化氫[14]。Adachid等[15]在2003年首次發(fā)現(xiàn)連續(xù)劑量的百草枯可致膽固醇過氧化和肺損傷。Chen等[16]研究顯示,百草枯處理過小鼠的肺髓過氧化物酶活性、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和4-羥基壬醛(4-hydroxyneonal)蛋白活性升高，這進(jìn)一步證實(shí)了氧化應(yīng)激損傷在百草枯致肺纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

4 非編碼RNA與百草枯中毒機(jī)制

4.1 MicroRNA (miRNA) 與百草枯中毒 miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能夠與mRNA 的3’UTR(3’-untranslated region)互補(bǔ)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或降低mRNA的穩(wěn)定，從而調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)[17]，間接調(diào)控多種生物學(xué)行為，如增生、分化和凋亡。miRNA除可在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用外，近來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在百草枯中毒中也扮演著重要角色。

黃敏等[18]用微陣列測序分析百草枯誘導(dǎo)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)的miRNA測序譜顯示，隨著百草枯濃度的增加,miR-Let-7e表達(dá)水平持續(xù)下降,而miR-34a表達(dá)水平持續(xù)上升,bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，且與miR-34a的表達(dá)量呈劑量—效應(yīng)關(guān)系；這說明miRNAs的異常表達(dá)參與了PQ致PC12細(xì)胞損傷過程，同時PQ可能通過上調(diào)miR-34a表達(dá)增加bcl-2蛋白表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡。朱勇[19]在百草枯致肺纖維化模型中發(fā)現(xiàn)HIF-1α及其靶基因micro RNA-210(miR-210)存在相互調(diào)控關(guān)系，并在致肺纖維化中對EMT有重要作用。PQ中毒后，大鼠肺組織即有HIF-1α表達(dá)顯著升高；上皮標(biāo)志物ZO-1和E-cadherin表達(dá)減少,間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA明顯增多,即發(fā)生了EMT；miR-210表達(dá)明顯增加。在細(xì)胞內(nèi)沉默HIF-1α后，Snail和β-catenin表達(dá)明顯減少,PQ中毒誘導(dǎo)的EMT程度減輕；miR-210表達(dá)明顯下降。而體外過表達(dá)miR-210后,間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA進(jìn)一步增多,上皮標(biāo)志物ZO-1和E-cadherin進(jìn)一步減少,EMT程度加重,HIF-1α表達(dá)增多；抑制miR-210后,明顯減輕PQ中毒誘導(dǎo)的EMT,HIF-1α顯著減少。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，HIF-1α和miR-210之間存在正反饋調(diào)控,細(xì)胞內(nèi)HIF-1α增多,一方面調(diào)節(jié)EMT,另一方面進(jìn)一步促進(jìn)miR-210表達(dá),形成惡性循環(huán),不斷促進(jìn)PQ誘導(dǎo)的EMT和肺纖維化發(fā)生發(fā)展；HIF-1α可能是治療PQ中毒致肺纖維化的一個潛在靶點(diǎn)。蔡志鵬[20]用百草枯誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞，探討miR-380-3p在百草枯致神經(jīng)細(xì)胞損害中的作用及其與Nrf2的關(guān)系。用qRT-PCR觀察細(xì)胞mRNA表達(dá)水平，顯示百草枯可下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)miR-380-3p的表達(dá)水平，而轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的激活可以上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)miR-380-3p表達(dá)水平，miR-380-3p的過表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞(Neuro-2a)增殖活性下降、凋亡率升高及周期阻滯。詹燕婷[21]通過實(shí)驗(yàn)觀察miR-17-5p功能獲得與功能失去在PQ致小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(Neuro-2a)增殖、凋亡、細(xì)胞周期改變中的影響，PQ可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞miR-17-5p表達(dá)下調(diào)和DNA甲基化水平升高；這說明miR-17-5p參與PQ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的改變。

因此，miRNA可以作為一種新的研究標(biāo)志物，降低或抑制miRNA在體內(nèi)的表達(dá)，從而引起百草枯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的改變，為百草枯中毒、治療、預(yù)后提供一個新的思路。

4.2 lncRNA與百草枯中毒 lncRNA是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，過去人們認(rèn)為lncRNA是轉(zhuǎn)錄“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能[22]。近年來隨著對lncRNA的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程；同時也在劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用[23-25]。在Salmena等[26]提出ceRNA概念后，科研人員發(fā)現(xiàn)lncRNA因miRNA含有某個或多個反應(yīng)元件(microRNA response elements，MREs)，可與mRNAs競爭性結(jié)合miRNAs，從而調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)，參與肺纖維化、腫瘤、百草枯中毒等疾病的發(fā)生發(fā)展。近年來，有不少學(xué)者研究lncRNA作為調(diào)控生命活動的重要大分子在百草枯中毒中所扮演的重要角色，從而為百草枯中毒治療、防治提供新的靶點(diǎn)。

楊虹雨等[27]研究了A07-17-0016 lncRNA NR_030777 在百草枯致神經(jīng)細(xì)胞損害中對Zfp326/Cpne5 表達(dá)的調(diào)控及對細(xì)胞增殖凋亡的影響，PQ 處理可引起小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuro-2a, N2a)增殖活力下降，細(xì)胞凋亡增加，NR_030777 LncRNANR_030777表達(dá)升高，Zfp326 mRNA 表達(dá)降低，Cpne5 mRNA表達(dá)升高；敲低NR_030777，會使PQ誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞增殖活力、Zfp326 mRNA、Cpne5 mRNA表達(dá)量受到抑制；而過表達(dá) NR_030777，會使PQ誘導(dǎo)的Zfp326 mRNA、Cpne5 mRNA表達(dá)量產(chǎn)生一定的協(xié)同作用；同時能夠拮抗 PQ 對細(xì)胞的毒性。此研究說明，lncRNA能夠調(diào)控mRNA分子的表達(dá)，并能夠抵抗百草枯誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損害作用。

張銀銀等[28]研究lncRNA-AK039862在PQ誘導(dǎo)的小鼠帕金森病模型中發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK039862在PQ抑制神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞和/或多巴胺能細(xì)胞增殖活力中起到協(xié)同作用；可在PQ處理的神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞中正向調(diào)控Foxa1基因轉(zhuǎn)錄過程,并促進(jìn)Pafah1b1轉(zhuǎn)錄、翻譯過程。陳俊杰[29]通過構(gòu)建百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型，抽取小鼠肺組織，行l(wèi)ncRNA芯片分析，發(fā)現(xiàn)多種lncRNA參與小鼠肺纖維化過程，選取其中差異表達(dá)的lncRNAuc.77及2700086A05Rik轉(zhuǎn)染至人肺腺癌細(xì)胞(A549)，發(fā)現(xiàn)其靶基因ZEB2及HOXA3表達(dá)明顯變化,并引起細(xì)胞形態(tài)改變,促進(jìn)纖維化相關(guān)基因表達(dá)變化。以上的研究說明，lncRNA可以發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能，從而影響細(xì)胞的生命活力。

5 小結(jié)與展望

非編碼RNA雖然不能編碼蛋白質(zhì)，但能夠與具有同源性的DNA和RNA結(jié)合，從而調(diào)節(jié)信息表達(dá)；也可以通過折疊其二級結(jié)構(gòu)，參與轉(zhuǎn)錄前和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。綜上所述，非編碼RNA在百草枯中毒機(jī)制的研究中，其主要通過信號通路、細(xì)胞因子、蛋白分子的參與，或競爭性地結(jié)合miRNA調(diào)控EMT進(jìn)程，調(diào)控相關(guān)凋亡蛋白分子等發(fā)揮影響。非編碼RNA 在百草枯中毒機(jī)制研究取得的進(jìn)展，為百草枯中毒治療提供了非常有價值的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。但目前，針對非編碼RNA在百草枯中毒機(jī)制的研究尚處于起始階段，很多問題尚未解決，如非編碼RNA如何在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)信號通路、相關(guān)蛋白分子，又有哪些非編碼RNA分子介導(dǎo)了炎性反應(yīng)—免疫反應(yīng)調(diào)控。這些問題引導(dǎo)臨床繼續(xù)深入探究非編碼RNA在百草枯中毒中所起的作用。