陳夢(mèng)瑤，尚莉麗

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

支氣管哮喘（以下簡(jiǎn)稱“哮喘”）是小兒常見的以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾?。?］，其發(fā)病機(jī)制主要是Th1／Th2細(xì)胞因子失衡［2］，主要采用支氣管舒張劑聯(lián)合糖皮質(zhì)激素霧化吸入治療，雖然起效快，癥狀緩解迅速，但存在復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)等不足［3］。Meta分析顯示，中醫(yī)藥在防治哮喘方面具有一定優(yōu)勢(shì)［4］。本課題所研究的熄風(fēng)定喘方，是尚莉麗教授的自擬方，以小青龍湯為主方，佐以全蝎、僵蠶、地龍等熄風(fēng)止痙的蟲類中藥組成。針對(duì)哮喘，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為小青龍湯的治療作用集中表現(xiàn)為抑制炎癥反應(yīng)以平喘［5-7］，熄風(fēng)止痙類中藥有解肌平喘的功效［8］。前期臨床研究顯示，以小青龍湯為主方的咳喘平顆?？赏ㄟ^下調(diào)抑炎因子、上調(diào)促炎因子而控制炎癥反應(yīng)以發(fā)揮治療作用，但加用熄風(fēng)止痙類中藥后作用機(jī)制不清楚。血清肥大細(xì)胞羧肽酶（mast cell carboxypetidase，MC-CP）、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）是Th2細(xì)胞因子（抑炎因子）的代表，γ-干擾素（interferonγ，IFN-γ）是Th1細(xì)胞因子（促炎因子）的代表，其在哮喘發(fā)病機(jī)制中研究較少［9］。因此，本研究主要探討熄風(fēng)定喘方對(duì)寒哮型哮喘模型豚鼠氣道炎癥的影響，以其為臨床提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物普通級(jí)雄性豚鼠72只，3～4周齡，體質(zhì)量（165±15）g，由南京市浦口區(qū)菜芙養(yǎng)殖場(chǎng)提供，蘇州大學(xué)技術(shù)與環(huán)境研究所質(zhì)檢，合格證號(hào)SCXX（蘇）2019-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)（梅山路校區(qū)）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自然采光，室內(nèi)溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度50%～70%，飼養(yǎng)環(huán)境安靜通風(fēng)。本實(shí)驗(yàn)符合安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定和要求，倫理批號(hào)：AHUCMguinea pigs2020007。

1.2 藥物與試劑熄風(fēng)定喘方（炙麻黃5 g，炒白芍10 g，細(xì)辛3 g，炙甘草3 g，干姜3 g，桂枝6 g，醋五味子6 g，姜半夏10 g，炒杏仁10 g，全蝎3 g，僵蠶10 g，地龍10 g，以上均為單味顆粒劑，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供）；地塞米松片（上海上藥信宜藥廠有限公司，批號(hào)：2980605）。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：A5253）；氫氧化鋁Al（OH）3佐劑（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：HG3185782）；氨基甲酸乙酯（美國(guó)Aladdin公司，批號(hào)：U108629）；生理鹽水（上海第一生化藥業(yè)公司，批號(hào)：060210）；MC-CP試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào)：20201109）；IFNγ、IgE試劑盒（武漢基因美科技有限公司，批號(hào)：GR2021-01、GR2021-01）。

1.3 儀器酶標(biāo)儀（雷杜，型號(hào)：RT-6000）；離心機(jī)（安徽嘉文，型號(hào)：JW3021HR）；漩渦混合器（其林貝爾儀器制造公司，型號(hào)：GL-88B）；電熱恒溫箱（上海三發(fā)，型號(hào)：DNP-9052BS-Ⅲ）。

2 方法

2.1 模型復(fù)制將72只豚鼠隨機(jī)選擇12只為正常組，其余豚鼠分別于第8天和第15天腹腔注射1 mL致敏液（100μg OVA＋1 mg Al（OH）3）致敏，第22天開始用1%OVA霧化激發(fā)，每次30 min，結(jié)束后給予寒冷刺激1 h，連續(xù)霧化7 d，從而激發(fā)豚鼠哮喘；正常組用生理鹽水替代致敏和霧化，其余操作相同。

2.2 動(dòng)物分組與給藥待豚鼠出現(xiàn)張口呼吸伴喘息、頻率加快、腹部翕動(dòng)、躁動(dòng)不安、搔抓顏面皮毛、咳嗽時(shí)發(fā)毛豎立，易激惹等現(xiàn)象說明成功引發(fā)豚鼠哮喘，引喘成功后，將模型隨機(jī)分為模型組、熄風(fēng)定喘方低劑量組（5.68 g·kg-1）、熄風(fēng)定喘方中劑量組（11.36 g·kg-1）、熄風(fēng)定喘方高劑量組（22.72 g·kg-1）和地塞米松組（5 mg·kg-1），每組各12只豚鼠，各組給予相應(yīng)的藥物21 d。

2.3 觀察豚鼠的一般行為學(xué)觀察各組大鼠體質(zhì)量、神態(tài)、飲食、呼吸、紫紺、毛色等情況進(jìn)并進(jìn)行記錄。

2.4 檢測(cè)血清相關(guān)指標(biāo)末次給藥后的2 h后，以20%烏拉坦（1.5 g·kg-1）腹腔注射豚鼠，輔助動(dòng)脈取血后，檢測(cè)血清中的MC-CP、IgE、IFN-γ水平。

2.5 HE染色觀察肺組織病理形態(tài)變化取血后剖胸，取右肺上葉組織置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定，并按照HE染色的步驟進(jìn)行切片的制備，在顯微鏡下觀察氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況、肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)、氣道上皮損傷等病理形態(tài)改變。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，先正態(tài)檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊，組間比較采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組豚鼠的一般情況正常組豚鼠皮毛光澤、活動(dòng)自如、反應(yīng)靈敏、呼吸平穩(wěn)、毛色光潔、飲食正常；模型組豚鼠出現(xiàn)呼吸加快、張口喘息、口唇發(fā)紺、腹部翕動(dòng)、四肢癱軟、煩躁不安、搔抓顏面皮毛、咳嗽時(shí)毛發(fā)豎立、被毛逆亂、易激惹等現(xiàn)象，且皮毛干枯、稀疏，飲水量增多，活動(dòng)頻率與食欲減少，反應(yīng)遲鈍，身材瘦削，體重減輕；熄風(fēng)定喘方低、中、高劑量組與地塞米松組豚鼠亦出現(xiàn)喘息，但癥狀較輕，且時(shí)而躁動(dòng)、激惹征等表現(xiàn)較模型組不明顯，被毛順滑、顏面皮毛潤(rùn)澤、行動(dòng)靈活、食欲較模型組有改善。

3.2 各組豚鼠血清中MC－CP、IgE、IFN－γ結(jié)果比較與正常組比較，模型組豚鼠血清中MC-CP、IgE水平極顯著升高（P＜0.01），IFN-γ水平極顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，熄風(fēng)定喘方低、中、高劑量組及地塞米松組豚鼠血清中MC-CP、IgE水平顯著降低（P＜0.05），IFN-γ水平顯著升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組豚鼠血清中MC－CP、IgE、IFN－γ水平比較（±s）

表1 各組豚鼠血清中MC－CP、IgE、IFN－γ水平比較（±s）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

組別 n 劑量 MC-CP LgE IFNγ正常組12 - 2.04±0.29 2.82±0.19 66.78±5.69模型組 12 - 10.75±0.71＃＃ 12.88±1.12＃＃ 14.45±3.90＃＃熄風(fēng)定喘方低劑量組 12 5.68 g·kg-1 7.48±0.90* 6.37±0.45* 20.87±1.98*熄風(fēng)定喘方中劑量組 12 11.36 g·kg-1 6.77±0.99* 5.25±0.66* 29.41±3.40*熄風(fēng)定喘方高劑量組 12 22.72 g·kg-1 3.99±0.74* 3.99±0.43* 31.87±5.06*地塞米松組 12 5 mg·kg-1 4.32±0.64* 4.17±0.32* 22.39±3.54*

3.3 各組豚鼠肺組織病理結(jié)果正常組豚鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，組織內(nèi)未見水腫部位，氣管黏膜上皮完整，管腔內(nèi)光滑平整無黏液、無狹窄及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組豚鼠病變部位見明顯水腫，管腔狹窄，黏液細(xì)胞不規(guī)則增生，可見黏液栓，上皮細(xì)胞壞死脫落，管壁有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基底膜厚度明顯增加；地塞米松組豚鼠肺組織黏膜仍有充血水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組明顯減輕，病變處只見少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔寬度較模型組明顯擴(kuò)大且無明顯黏液栓形成，上皮結(jié)構(gòu)也較完整；熄風(fēng)定喘方低劑量組豚鼠肺組織管腔狹窄、管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等程度亦有所降低；熄風(fēng)定喘方中劑量組的管腔縮小，壁內(nèi)見少許炎性細(xì)胞；熄風(fēng)定喘方高劑量組豚鼠肺組織管腔擴(kuò)大，壁內(nèi)無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 各組豚鼠肺組織病理形態(tài)觀察（HE染色，×400）

4 討論

哮喘是小兒常見的一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要表現(xiàn)為氣道炎癥、免疫與變態(tài)反應(yīng)、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)和遺傳等方面，主要以嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞為主，包括T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞組分參與［10］。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘重要的發(fā)生機(jī)制是T細(xì)胞（Th1／Th2）的免疫調(diào)節(jié)失衡，表現(xiàn)為Th2細(xì)胞因子功能相對(duì)激發(fā)，Th1細(xì)胞因子功能相對(duì)受抑制［11］。Th1細(xì)胞因子分泌的減少和Th2細(xì)胞因子分泌的增加，均直接或間接增加IgE的合成，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒，發(fā)生氣道炎癥反應(yīng)［12］。其中肥大細(xì)胞分泌出一種重要的炎癥介質(zhì)——MC-CP［13-14］，約占肥大細(xì)胞蛋白總量的12%，對(duì)肥大細(xì)胞分化起重要作用。當(dāng)哮喘患兒接觸致敏原后，機(jī)體出現(xiàn)IgE橋聯(lián)，引發(fā)肥大細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［15］。研究表明，在嚴(yán)重的急性變態(tài)反應(yīng)發(fā)生過程中，患兒血液或體液中會(huì)存在大量肥大細(xì)胞釋放的活化脫顆粒，致使MC-CP水平在血液及體液中急劇升高而加劇炎癥反應(yīng)［16］。哮喘急性發(fā)作患者血液中MC-CP水平與IgE呈正相關(guān)［9］。作為Th1細(xì)胞因子的代表IFN-γ，其原名為巨噬細(xì)胞活化因子，可以調(diào)節(jié)哮喘小鼠Th1／Th2平衡，抑制杯狀細(xì)胞增生，減輕呼吸道阻力［17］。IFN-γ不僅能促進(jìn)Th0向Th1細(xì)胞分化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞免疫應(yīng)答，還可以抑制Th2細(xì)胞表型的分化和功能，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活化補(bǔ)體等，對(duì)免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)具有重要作用，有助于對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體進(jìn)行清除［18］。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ能抑制Th2細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4），進(jìn)而抑制IgE的合成，減輕氣道的慢性炎癥，避免患者哮喘的進(jìn)一步發(fā)展［19-20］。

支氣管哮喘屬于中醫(yī)“哮病”的范疇，《證治匯補(bǔ)》闡述其病機(jī)責(zé)之于胸中氣之壅塞，膈間又有頑痰之膠著，再有外寒之侵襲，導(dǎo)致氣道不暢，發(fā)為哮喘［21］。哮喘發(fā)作的內(nèi)在病因合為“伏風(fēng)”與“痰飲”［22］，即常因感受外邪或接觸異物而誘導(dǎo)伏風(fēng)發(fā)動(dòng)，即外風(fēng)引動(dòng)內(nèi)風(fēng)則哮喘發(fā)作。哮病有寒熱之分，冷哮最為常見。全身或局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素是治療哮喘的首選，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)激素依賴性和抑制免疫細(xì)胞，從而加重或誘發(fā)感染等不良反應(yīng)。中醫(yī)治療可以調(diào)控患者自身的免疫機(jī)制，改善患者的氣道反應(yīng)以及細(xì)胞、介質(zhì)等水平，改善臨床癥狀［23］。哮喘發(fā)作期，外風(fēng)引動(dòng)內(nèi)風(fēng)，來勢(shì)洶洶，喘息明顯，肺失宣肅，即急則治其標(biāo)，結(jié)合歷代醫(yī)家觀點(diǎn)冷哮型哮喘宜溫化或宣散，尚莉麗教授認(rèn)為輔以熄風(fēng)止痙藥物，更以祛毒平喘。本研究中的熄風(fēng)定喘方是尚莉麗教授的經(jīng)驗(yàn)方，以小青龍湯為基礎(chǔ)加減化裁而成，組方為炙麻黃、炒白芍、細(xì)辛、干姜、炙甘草、桂枝、醋五味子、姜半夏、炒杏仁、全蝎、僵蠶、地龍。熄風(fēng)定喘方在辨寒熱的基礎(chǔ)上，重用全蝎、僵蠶、地龍等蟲類藥，正如葉天士所言：“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)，輒仗蠕動(dòng)之物松透病根”［24］。此類中藥因其性擅走竄、無所不至，故可深入肺絡(luò)搜邪、祛除內(nèi)風(fēng)與毒邪，最終使肺氣宣降得宜、內(nèi)風(fēng)得息、氣道攣急得以緩解。

小青龍湯作為熄風(fēng)定喘方的基礎(chǔ)方，臨床主治外寒內(nèi)飲，具有抗感染、平喘、抗過敏等作用，能夠改善肺部通氣狀況、干預(yù)氣道重塑［25］。研究發(fā)現(xiàn)，小青龍湯不僅可以抑制IgE的生成，拮抗氣道變應(yīng)性炎癥［26］，還可抑制氣道重塑、降低氣道反應(yīng)性［11］等，以改善支氣管哮喘患者咳嗽、喘息、咯痰等臨床癥狀。配伍的全蝎、僵蠶、地龍等蟲類藥有減輕呼吸道炎癥，緩解支氣管痙攣等作用［27］。其中僵蠶能夠減少IL-4水平，調(diào)節(jié)Th1／Th2平衡控制氣道炎癥；全蝎具有免疫抑制、改善慢性氣道炎癥，實(shí)現(xiàn)氣道重構(gòu)；地龍具有舒緩氣道平滑肌痙攣，有效擴(kuò)張支氣管的作用，因此其止咳平喘效果顯著［3］。

基于以上研究，本研究復(fù)制出適應(yīng)熄風(fēng)定喘方組方特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，選取MC-CP、IgE、IFN-γ為寒性哮喘豚鼠的檢測(cè)指標(biāo)，并結(jié)合豚鼠肺組織病理，更準(zhǔn)確地揭示熄風(fēng)定喘方治療哮喘的藥效。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，熄風(fēng)定喘方組豚鼠的行為學(xué)有改善；豚鼠血清MC-CP、IgE水平顯著降低，IFN-γ水平顯著升高，病理結(jié)果顯示豚鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)減輕。提示熄風(fēng)定喘方可能通過降低哮喘豚鼠MC-CP、Ig-E水平、升高IFN-γ水平，改善肺功能以防治哮喘氣道炎癥。