冀 杰，羅艷華，孔 寧，林斌武

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000；2.廣州市番禺中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400)

資料顯示，全世界范圍內(nèi)糖尿病患者高達(dá)4.25億人，國(guó)內(nèi)糖尿病患者高達(dá)1.14億人，隨著糖尿病患者的增加糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病率也急劇增加，該病會(huì)導(dǎo)致盲性眼病，給患者、家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。目前，治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要方法包括玻璃體切割術(shù)和激光光凝術(shù)，但上述治療方法會(huì)損傷患者的視力，且給患者視力帶來(lái)不適感，具有一定的局限性[3-4]。故研究有效的治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物尤為重要。中醫(yī)藥防治糖尿病視網(wǎng)膜病變已成為中醫(yī)眼科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5]，消朦靈方是臨床常用于治療視網(wǎng)膜病變的中藥方劑，具有益氣養(yǎng)陰、活血明目的功效，但其治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的具體機(jī)制尚不清楚?；诖?，本研究將探討消朦靈方在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的75只8周齡雄性SD大鼠，體重180～220 g，動(dòng)物合格證號(hào)：0020829。飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，保持空氣流通，溫度為25～27 ℃，12 h光照維持，給予充足的飼料與水。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物及試劑：購(gòu)自美國(guó)Slgma公司生產(chǎn)的鏈尿佐菌素；購(gòu)自胱化學(xué)試劑廠(chǎng)生產(chǎn)的檸檬酸鈉和檸檬酸；購(gòu)自美國(guó)雅培公司生產(chǎn)的血糖試紙；購(gòu)自北京中杉金橋公司生產(chǎn)的GAPDH內(nèi)參；購(gòu)自瑞士羅氏公司7600型全自動(dòng)生化分析儀；購(gòu)自江蘇酶免公司生產(chǎn)的白細(xì)胞介素6(Interleukin 6，IL-6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細(xì)胞介素1β(Interleukin 1β，1L-1β)及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒；購(gòu)自福州飛凈生物科技公司生產(chǎn)的蘇木素伊紅試劑盒；消朦靈方組成：黨參、瓦楞子、毛冬青各30 g，麥冬15 g，五味子5 g，田七3 g。由我院中藥方提供。取上述藥材后用4500 g水浸泡45 min，用武火煮沸，文火煮30 min，取藥液備用；用1500 g水進(jìn)行2次煎煮，20 min后與第一藥液混合，濃縮，獲得含生藥量2 g/ml的溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模：75只大鼠隨機(jī)取15只為空白組，采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。剩余60只大鼠采用高脂飼料(66.5%標(biāo)準(zhǔn)飲食，2.5%膽固醇，1.0%膽汁酸，20%蔗糖，10%豬油)，1周后，對(duì)其空腹血糖進(jìn)行測(cè)量，并稱(chēng)體重，建立糖尿病模型(采用一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素50 mg/kg)。注射72 h后對(duì)大鼠空腹血糖進(jìn)行測(cè)定，以大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L為高血糖大鼠，本研究中60只大鼠均造模成功。造模成功后繼續(xù)高脂高糖飲食喂養(yǎng)1個(gè)月，至大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗、高血糖則為構(gòu)建糖尿病大鼠模型成功。糖尿病大鼠造模成功后繼續(xù)高脂高糖飲食喂養(yǎng)1個(gè)月，直至大鼠出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變，則為糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠造模成功。糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型評(píng)價(jià)：隨機(jī)取6只大鼠禁食1晚后，對(duì)空腹胰島素、血糖及葡萄糖耐量進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)胰島素抵抗，空腹血糖≥11.1 mmol/L，且行HE染色，大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生視網(wǎng)膜病變，則為造模成功。

1.2.2 分組及給藥方法：隨機(jī)將60只糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠分為高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組，每組15只，各組根據(jù)人與動(dòng)物表面積折算法按照6.8、3.4、1.7 mg/(kg·d)灌胃，空白組以0.9%氯化鈉溶液灌胃，模型組以溫開(kāi)水灌胃，連續(xù)給藥2個(gè)月。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

1.3.1 體重及血糖測(cè)量：每日7∶30測(cè)量大鼠體重及空腹血糖。

1.3.2 生化指標(biāo)及IL-6、VEGF、1L-1β、TNF-α水平測(cè)定：取60 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉后，將完整眼球摘除，剪下角膜，分離晶狀體、玻璃體，再將視網(wǎng)膜分離。取一半視網(wǎng)膜組織制成勻漿后離心，取上清液分成2份，1份采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL-C)、甘油三酯(Triglycerides，TG)及總膽固醇(Total cholesterol，TC)；另一份采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平進(jìn)行測(cè)定。另一部保存于40 g/L甲醛溶液中備用。

1.3.3 檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)：沖洗、固定視網(wǎng)膜組織，石蠟包埋切片，洗脫后，沖洗，置于超純水中，孵育15 min，洗滌2次(超純水)。加入TUNEL反應(yīng)液，黑暗孵育1 h，沖洗2次，封片。熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞凋亡：發(fā)射波長(zhǎng)535 nm、激發(fā)波長(zhǎng)552 mm下顯綠色熒光細(xì)胞。隨機(jī)取8個(gè)視野計(jì)數(shù)，對(duì)凋亡指數(shù)進(jìn)行計(jì)算后，各組取平均值。凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4 視網(wǎng)膜組織血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)、VEGF及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)蛋白表達(dá)水平采用Western blot檢測(cè)：取RIPA裂解液對(duì)視網(wǎng)膜組織進(jìn)行裂解后提取總蛋白，蛋白濃度采用BCA蛋白濃度檢測(cè)。經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠對(duì)每組50 μg蛋白上樣量進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，孵育過(guò)夜，洗膜后，采用ECL化學(xué)發(fā)光發(fā)檢測(cè)，拍照，內(nèi)參為β-actin，借助Image J分析軟件對(duì)各組的視網(wǎng)膜組織中的Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)算。

1.3.5 視網(wǎng)膜組織Ang-1、VEGF及VEGFR2表達(dá)水平采用qRT-PCR法檢測(cè)：視網(wǎng)膜組織總RNA采用Trizol法提取，其水平采用酶標(biāo)儀檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄總RNA得到cDNA，Ang-1、VEGF及VEGFR2表達(dá)水平均采用SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。由上海生工公司設(shè)計(jì)合成的引物。Ang-1、VEGF及VEGFR2上游依次為5’-TAAATCAAACATCCCTCTT-3’、5’-CCTGGCTTACTGCTGTACCT-3’、5’-GCCGGCATGGTCTTCTGTGAG-3’；Ang-1、VEGF及VEGFR2下游依次為5’-AGGTGTCCAGCTCTTCCT-3’、5’-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3’、5’-GGGGCTCACGGACCACATCATCTAA-3’。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min及變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，連續(xù)40個(gè)循環(huán)，再次72 ℃延伸10 min。根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算Ang-1、VEGF及VEGFR2表達(dá)量，上述樣本量需檢測(cè)3次。

2 結(jié) 果

2.1 各組體重和血糖比較 見(jiàn)表1。造模前，各組體重及血糖水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；造模成功后第1天，高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的體重低于空白組，血糖高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療后，各組體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；空白組、高劑量組血糖水平低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組血糖水平低于低劑量組及模型組，低劑量組血糖水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；高劑量組血糖水平與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組生化指標(biāo)水平比較 見(jiàn)表2。治療后，高劑量組、空白組HDL-C、LDL-C、TG及TC水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組HDL-C、LDL-C、TG及TC水平低于低劑量組及模型組，低劑量組HDL-C、LDL-C、TG及TC水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；高劑量組HDL-C、LDL-C、TG及TC水平與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.3 各組IL-6、1L-1β及TNF-α水平比較 見(jiàn)表3。治療后，高劑量組、空白組IL-6、1L-1β及TNF-α水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組IL-6、1L-1β及TNF-α水平低于低劑量組及模型組，低劑量組IL-6、1L-1β及TNF-α水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；高劑量組IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 各組體重和血糖比較

表2 各組生化指標(biāo)水平比較(mmol/L)

表3 各組IL-6、1L-1β及TNF-α水平比較(pg/ml)

2.4 各組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4。治療后，高劑量組、空白組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)水平低于低劑量組及模型組，低劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；高劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)水平與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.5 各組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平比較 見(jiàn)表5。治療后，高劑量組、空白組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平低于低劑量組及模型組，低劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組Ang-1、VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)水平比較

表5 各組Ang-1、VEGF及VEGFR2 mRNA水平比較

2.6 各組細(xì)胞凋亡情況比較 見(jiàn)表6(圖1)。各組比較治療后，高劑量組、空白組細(xì)胞凋亡指數(shù)均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)低于低劑量組及模型組，低劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)低于模型組，各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)高于空白組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表6 各組細(xì)胞凋亡情況比較

圖1 TUNEL染色法檢測(cè)各組大鼠細(xì)胞凋亡(TUNEL染色，×400)

3 討 論

在中醫(yī)學(xué)中將糖尿病視網(wǎng)膜病變歸屬于“消渴目病”的范疇[6]，古籍可見(jiàn)《秘傳證治要訣·三消》曰：“三清久之，精血既虧。或目無(wú)視，或手足偏廢如風(fēng)疾”。由此可得出該病之本為陰虛燥熱、脾虛氣弱，血瘀貫穿始終，屬于本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證。故治則為益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)。消朦靈方方中黨參歸脾、肺經(jīng)，能夠補(bǔ)中益氣、健脾益肺，養(yǎng)血生津；瓦楞子歸肺、胃、肝經(jīng)，可補(bǔ)脾益氣、滋咳潤(rùn)肺、緩急解毒、調(diào)和百藥；毛冬青歸肺、肝、大腸經(jīng)，可清熱解毒、活血通脈；麥冬歸肺、心、胃經(jīng)，可養(yǎng)陰潤(rùn)肺，益胃生津，清心除煩；五味子歸肺、腎、心經(jīng)，可斂肺滋腎、生津斂汗、澀精止瀉、寧心安神；田七歸肝、胃經(jīng)，可化瘀止血、活血定痛。諸藥合用共奏益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、通脈散結(jié)明目之功效。

李錦等[7]通過(guò)的研究指出，中藥方劑聯(lián)合針刺治療非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變有顯著的療效。程艷春等[8]的研究也指出，中藥方劑能夠降低單純型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血糖水平，改善患者臨床癥狀，效果顯著。本研究結(jié)果顯示，造模成功后第1天，高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的體重低于空白組，血糖高于空白組；治療后，空白組、高劑量組血糖及生化指標(biāo)水平低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組血糖及生化指標(biāo)水平低于低劑量組及模型組，低劑量組血糖及生化指標(biāo)水平低于模型組，提示消朦靈方能夠有效降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變血糖及生化指標(biāo)水平，且與劑量密切相關(guān)。

IL-1β屬于多效性細(xì)胞因子，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞具有激活作用，致使糖尿病視網(wǎng)膜病變的神經(jīng)炎性反應(yīng)和進(jìn)行性神經(jīng)緣與血管變性[9]。TNF-α是重要的炎癥因子之一，主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠增加局部炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放凝血因子及啟動(dòng)凝血過(guò)程等作用。在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中的纖維血管膜浸潤(rùn)細(xì)胞、視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)中存在有大量的TNF-α，其能夠誘導(dǎo)新血管生成。其水平越高表示糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的預(yù)后不佳[10-11]。IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促使其形成新的血管，導(dǎo)致血管滲透性增加，進(jìn)而誘發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變[12]。本研究結(jié)果顯示，治療后，高劑量組、空白組IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平低于低劑量組及模型組，低劑量組IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平低于模型組，提示消朦靈方能夠有效降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變大鼠IL-6、VEGF、1L-1β及TNF-α水平，降低炎癥反應(yīng)，可減少高血糖對(duì)視網(wǎng)膜的損害。

Ang-1是形成成熟血管所必需的，其與內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶2結(jié)合發(fā)揮作用，致使內(nèi)皮細(xì)胞通透性降低，對(duì)VEGF具有調(diào)節(jié)作用，維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。VEGF是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的重要因素，可使血管通透性增加，導(dǎo)致血-視網(wǎng)膜屏障功能破壞，致視網(wǎng)膜血管滲漏，且對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移具有刺激作用，誘發(fā)視網(wǎng)膜內(nèi)形成新生血管，損害視功能[13]。在糖尿病視網(wǎng)膜病變中VEGF/VEGFR2發(fā)揮了重要作用，VEGF與VEGFR2的高親和力結(jié)合并誘導(dǎo)VEGFR2的磷酸化而發(fā)揮促血管生成活性；對(duì)VEGF-VEGFR2及其下游ERK1/2和p38信號(hào)通路進(jìn)行阻斷，對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞血管具有抑制作用[14-15]。本研究結(jié)果顯示，治療后高劑量組、空白組Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表達(dá)水平均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表達(dá)水平均低于低劑量組及模型組，低劑量組Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表達(dá)水平低于模型組，提示消朦靈方能夠有效降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變Ang-1、VEGF、VEGFR2蛋白及mRNA表達(dá)水平，改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度，能夠促使視網(wǎng)膜各層組織、毛細(xì)血管恢復(fù)。這可能是由于黨參具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等作用[16]。毛冬青具有抗壓、抗菌、抗血小板聚集、抗血栓、抗凝及對(duì)腦組織缺血、缺氧損傷的保護(hù)等多方面的作用[17]。麥冬具有降血糖、抗腫瘤、抗心肌缺血、免疫、抗氧化、抗過(guò)敏、保護(hù)外分泌腺等方面的藥理作用[18]。五味子具有抗腫瘤、保護(hù)肝臟、降糖、延緩衰老、抗菌抑菌、增強(qiáng)骨骼肌、中樞調(diào)節(jié)、抗疲勞與耐缺氧、改善泌尿生殖與心血管系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)等方面藥理作用[19]。田七具有止血、抗血小板聚集、抗心律失常、保護(hù)腦組織、降血壓、降血脂、抗炎、保肝、護(hù)腎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用[20]。

本研究進(jìn)一步分析了消朦靈方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的細(xì)胞凋亡情況及視網(wǎng)膜組織光學(xué)顯微鏡下結(jié)構(gòu)變化情況，結(jié)果顯示，治療后，高劑量組、空白組細(xì)胞凋亡指數(shù)均低于中劑量組、低劑量組及模型組，中劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)低于低劑量組及模型組，低劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)低于模型組；高劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)高于空白組，提示消朦靈方能夠降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變細(xì)胞凋亡指數(shù)。

綜上所述，消朦靈方能夠有效降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變血糖水平，降低炎癥水平，下調(diào)Ang-1、VEGF、VEGFR2水平，減少高血糖對(duì)視網(wǎng)膜的損害，降低細(xì)胞凋亡指數(shù)，促使視網(wǎng)膜各層組織、毛細(xì)血管恢復(fù)正常。