羅淑年，王立琦，于殿宇，王 瑩，周 琪，于長(zhǎng)華，劉天一*

（1 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 哈爾濱150028 2 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱 150030 3 九三食品有限公司 哈爾濱150010）

食用油脂是人們生活中不可缺少的能源物質(zhì)[1]。如果食用油脂中存在磷脂，就會(huì)影響油脂的品質(zhì)，如油脂的色澤和貨架期等[2]。脫膠是油脂精煉過程中的關(guān)鍵步驟，主要技術(shù)指標(biāo)為大豆毛油中的磷脂含量[3]。實(shí)驗(yàn)室中，檢測(cè)大豆油脂中磷脂類物質(zhì)常采用的方法是薄層色譜法[4]（Thin-layer chromatography，TLC）和高效液相色譜法[5]（High performance liquid chromatography，HPLC），此兩種方法存在缺陷，如TLC 法定量時(shí)需采用薄層掃描儀計(jì)算分值，干擾因素多，試驗(yàn)條件嚴(yán)苛，重復(fù)性較差[6]；HPLC 法的成本昂貴，同時(shí)需要復(fù)雜的前處理[7]。實(shí)際生產(chǎn)中，常采用280 ℃加熱試驗(yàn)的方法檢測(cè)脫膠后大豆油中磷脂的含量，該方法僅通過觀察油脂顏色變化以及絮狀沉淀的產(chǎn)生來判定磷脂含量，其結(jié)果并不準(zhǔn)確。

一般情況下，經(jīng)水化脫膠后，能夠?qū)⒂椭械牧字?0%左右，剩余磷脂為非水化磷脂，是多種磷脂組分的混合物，主要成分是磷脂酸[8]。尋找一種快速、無損并且精度較高的檢測(cè)磷脂酸含量的方法顯得尤為重要。

太赫茲波（Terahertz，THz）是頻率在0.1～10 THz 之間的電磁波，具有透視性、安全性和指紋性等特性[9]。太赫茲時(shí)域光譜（Terahertz time domain spectroscopy，THz-TDS）技術(shù)是一種嶄新的光譜探測(cè)技術(shù)，該技術(shù)基于超短相干脈沖的產(chǎn)生與探測(cè)原理[10]，通過測(cè)量輻射脈沖的電場(chǎng)振幅，可在其覆蓋的頻率范圍內(nèi)同時(shí)獲得太赫茲波的強(qiáng)度和相位信息，在材料的遠(yuǎn)紅外物性研究中有重要的應(yīng)用。由于脈沖具有低能性，不會(huì)使得生物分子產(chǎn)生光致電離，因此它是一種有效的無損檢測(cè)方法，非常適合于生物分子的研究[11-12]。太赫茲時(shí)域光譜分析作為一種檢測(cè)方法，獨(dú)特之處是具有較快的分析速度，對(duì)樣本內(nèi)部和外表沒有任何損壞，能同時(shí)獲得樣本的相位和振幅信息，且能測(cè)量分子間弱相互作用以及晶體中晶格低頻振動(dòng)等分子集體振動(dòng)信息[13]。

THz-TDS 作為一項(xiàng)高新分析技術(shù)，近年來得到迅速發(fā)展。李利龍等[14]采用透射型THz-TDS 測(cè)量?jī)煞N調(diào)和油、7 種植物油的THz 吸收譜，得到它們的特征吸收參數(shù)，對(duì)它們的特征吸收峰進(jìn)行分析和對(duì)比，最終得出結(jié)論，脂類有機(jī)大分子在THz波段存在差異性吸收。廉飛宇等[15]采用太赫茲時(shí)域光譜研究4 種食用油在0.2～1.6 THz 波段的延時(shí)特性和折射率特性，試驗(yàn)表明，相對(duì)于色譜法和其它理化檢測(cè)方法，太赫茲時(shí)域光譜法具有非破壞性、簡(jiǎn)單、安全可靠的特點(diǎn)。Liu 等[16]提出一種基于太赫茲光譜和化學(xué)計(jì)量工具的理化質(zhì)量參數(shù)，用于轉(zhuǎn)基因棉籽油的非破壞性快速鑒別方法，應(yīng)用偏最小二乘判別分析建立識(shí)別模型并對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，太赫茲光譜可用作鑒定不同的轉(zhuǎn)基因棉籽油及非轉(zhuǎn)基因棉籽油。Liu 等[17]研究使用太赫茲光譜法快速測(cè)定大豆油中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的可行性，將太赫茲吸收光譜與反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和t-SNE 預(yù)處理方法結(jié)合，獲得最佳模型，定量預(yù)測(cè)大豆油中AFB1濃度，并確定AFB1 的檢測(cè)限。目前已有對(duì)太赫茲光譜技術(shù)在油脂檢測(cè)方面的應(yīng)用研究，而對(duì)磷脂酸的分析未見相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)中首先將一級(jí)大豆油用硅膠處理，然后向大豆油中添加不同量的磷脂酸制得人工模擬毛油，在室溫下對(duì)樣品進(jìn)行太赫茲光譜掃描，得到大豆油脂樣品的時(shí)域譜，通過傅里葉變換和計(jì)算得到樣品的頻域譜和吸收譜。將樣品的吸收譜作為輸入變量建立偏最小二乘（Partial least squares，PLS）模型，研究其與高效液相色譜法檢測(cè)的磷脂酸實(shí)際含量的偏差，以期實(shí)現(xiàn)快速、無損檢測(cè)大豆油中的磷脂含量，為脫膠過程中大豆毛油殘磷量的動(dòng)態(tài)監(jiān)控分析奠定理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 材料與試劑

一級(jí)大豆油，九三集團(tuán)哈爾濱惠康食品有限公司；磷脂酸，河南明瑞食品添加劑有限公司；磷脂酸標(biāo)準(zhǔn)品，西格瑪化工公司；硅膠（200～300目），武漢市矽利康有機(jī)硅材料有限公司；正己烷（色譜純），天津順隆達(dá)科技公司；異丙醇（色譜純），天津市化學(xué)試劑三廠。以上試劑無特殊說明者均為分析純。

1.2 主要儀器、設(shè)備

Z-1 太赫茲系統(tǒng)，美國(guó)Zomega 公司；Waters1525 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；AR2140 電子精密天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；樣品池比色皿，江蘇晶科光學(xué)儀器設(shè)備制造廠；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪高科儀器廠；SZ-1 型快速混勻器，江蘇省金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；101-3-S 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；恒溫水浴振蕩器，金壇市順華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品油的制備 稱取200 g 硅膠（200～300目），放入托盤中，在105 ℃的烘箱中活化2 h。稱取50 mL 一級(jí)大豆油，加入到250 mL 錐形瓶中，再加入6 g 活化硅膠，在55 ℃，轉(zhuǎn)速85 r/min 的恒溫水浴振蕩器上振搖60 min，均勻吸附、離心后取上清液，添加一定量的磷脂酸，在40 ℃的磁力攪拌器上攪拌均勻，即可制備出大豆毛油樣品。重復(fù)以上操作，稱取不同量磷脂酸（精確到0.0001 g）溶解在經(jīng)硅膠吸附后的大豆油中，制備出105 份模擬脫膠大豆毛油樣品，編成1～105 號(hào)，并通過高效液相色譜檢測(cè)制得的105 個(gè)樣品中磷脂酸含量，測(cè)得其含量分布在0.0541～2.3941 g/50 g，平均值為0.9963 g/50 g，樣品范圍較適中，且在各個(gè)范圍內(nèi)的樣品分布個(gè)數(shù)比較均勻，保證了之后模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.3.2 太赫茲光譜的采集 本研究利用首都師范大學(xué)“太赫茲波譜與成像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”組建的太赫茲時(shí)域光譜系統(tǒng)對(duì)大豆油脂樣品進(jìn)行光譜采集，THz-TDs 系統(tǒng)的主要組成部件是美國(guó)Coherent 公司的Vitesse-800-5 型鈦藍(lán)寶石飛秒激光器以及美國(guó)Zomega 公司的Z-1 太赫茲系統(tǒng)，以ZnTe 為探測(cè)晶體，以鈦藍(lán)寶石激光器作為激發(fā)光源；平均功率為960 mW，脈寬為100 fs，重復(fù)頻率在82 MHz，中心波長(zhǎng)800 nm。THz 透射裝置如圖1所示：

圖1 THz 光譜系統(tǒng)透射模式光路原理圖Fig.1 Schematic diagram of the transmission mode optical path of the THz spectrum system

飛秒激光脈沖在透過分束棱鏡后被分為泵浦光（光路Ⅰ）和探測(cè)光（光路Ⅱ）兩束，泵浦光主要作用是激發(fā)太赫茲發(fā)射器產(chǎn)生太赫茲脈沖，探測(cè)光用于探測(cè)太赫茲脈沖和檢測(cè)太赫茲脈沖的場(chǎng)強(qiáng)[18]。泵浦光經(jīng)斬波器調(diào)制后通過一系列變化產(chǎn)生THz 脈沖，THz 脈沖通過一系列離軸拋物面鏡最終被聚焦在被測(cè)樣品上，然后攜帶樣品一定信息量的太赫茲脈沖與探測(cè)光共線并經(jīng)過ZnTe 晶體[19]。通過線性電光效應(yīng)，THz 脈沖的電場(chǎng)對(duì)ZnTe的折射率橢球進(jìn)行調(diào)制，改變探測(cè)脈沖的偏振態(tài)，通過檢測(cè)偏振，獲得正比于THz 電場(chǎng)的電信號(hào)。在延遲裝置的作用下，使探測(cè)光能夠探測(cè)太赫茲脈沖的電場(chǎng)強(qiáng)度，產(chǎn)生的光與探測(cè)光之間的光程差發(fā)生改變，從而獲得時(shí)域波形[20]。分別通過測(cè)量干燥氮?dú)夂痛蠖褂椭瑯悠返玫絽⒖夹盘?hào)和樣品信號(hào)，為減小光譜數(shù)據(jù)的測(cè)量誤差，以樣本3 次測(cè)量的平均值作為最終的光譜值。此外，由于水在太赫茲波段有強(qiáng)烈的吸收，為提高試驗(yàn)精度，需要將水分對(duì)試驗(yàn)的影響降到最低，所以檢測(cè)區(qū)域在充滿氮?dú)獾挠袡C(jī)玻璃罩中進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)溫度21 ℃，濕度小于4%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將時(shí)域信號(hào)進(jìn)行快速傅里葉變換得到參考信號(hào)和大豆油脂樣品的頻域信號(hào)，采用Dorney 等[21]和Duvillaret 等[22]提出的公式計(jì)算吸收系數(shù)，得到樣品的吸收譜。

式中：ω——角頻率；d——樣本的厚度；c——太赫茲波在空氣中的傳播系數(shù)；所涉及的φ（ω）和ρ（ω）變量為樣本的頻域信號(hào)與參考頻域信號(hào)作比后的比值函數(shù)所得；φ（ω）——比值函數(shù)的相位；ρ（ω）——比值函數(shù)的幅值。

2 結(jié)果與討論

2.1 太赫茲光譜分析

2.1.1 時(shí)域譜分析 采用上述THz-TDS 裝置，測(cè)量了參考信號(hào)（僅充滿干燥氮?dú)獾臉悠烦兀┖?～105 號(hào)大豆油脂樣品的太赫茲時(shí)域譜，為增加信噪比，每個(gè)樣本測(cè)量3 次，取其平均值作為測(cè)量結(jié)果，參考信號(hào)及105 個(gè)大豆油脂樣品的THz 時(shí)域譜波形如圖2所示，圖中黑線為參考信號(hào)的時(shí)域信號(hào)，其它彩色線條是大豆油脂樣品的時(shí)域信號(hào)。

由圖2 可知，試驗(yàn)測(cè)量中整個(gè)測(cè)量時(shí)間窗口為9 ps，在主峰出現(xiàn)后，參考波形及樣品的時(shí)域信號(hào)波形沒有出現(xiàn)若干個(gè)副峰，說明試驗(yàn)中測(cè)量容器的Fabry-Perot（FP）效應(yīng)幾乎沒有，可知FP 效應(yīng)對(duì)本次試驗(yàn)的影響較小[23]。同時(shí)可以看出，THz波經(jīng)過大豆油脂樣品時(shí)的波形基本一致，沒有發(fā)生明顯的變化。由于大豆油脂樣品的折射率大于氮?dú)庠谔掌澆ǘ蔚恼凵渎剩琓Hz 波在透過大豆油脂樣品后相對(duì)于參考信號(hào)在時(shí)間上均產(chǎn)生了不同程度的延遲[24]。不同磷脂酸含量的大豆油脂樣品對(duì)THz 波的吸收不同，導(dǎo)致THz 波在大豆油脂樣品中的損耗不同，使得波譜的振幅有不同的衰減及展寬。

圖2 大豆油樣品及參考信號(hào)的THz 時(shí)域譜Fig.2 THz time-domain spectrum of soybean oil samples and reference signals

2.1.2 頻域譜分析 將得到的大豆油脂樣品的時(shí)域譜進(jìn)行傅里葉變換得到其頻域譜，結(jié)果如圖3所示，圖中用不同顏色的曲線分別表示了參考信號(hào)及大豆油脂樣品的頻域譜。

由圖3 可知，參考信號(hào)頻域譜線比較平滑，說明FP 效應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的影響較小，系統(tǒng)的運(yùn)行環(huán)境較好[23]。太赫茲光能量值在0.1～2.6 THz 之間，參考信號(hào)和大豆油脂樣品的頻域譜波形基本相同，差別不大，太赫茲脈沖經(jīng)過大豆油脂樣品后，在該THz 頻段，幅值均有不同程度的降低，參考信號(hào)的振幅最高[25]，大豆油脂樣品的磷脂酸含量越高，其頻域譜的幅值越小，對(duì)THz 波的吸收強(qiáng)度越大。

圖3 油脂樣本及參考的THz 頻域譜Fig.3 THz frequency domain spectrum of oil sample and reference

2.1.3 吸收譜分析 利用1.4 節(jié)中的公式進(jìn)行計(jì)算，得到大豆油脂樣品的吸收譜，如圖4所示。在105 個(gè)大豆油脂樣品中隨機(jī)抽取3 個(gè)，進(jìn)行THz吸收譜波形的比較，3 個(gè)樣品的THz 吸收譜如圖5a、5b所示，其中圖5b 為圖5a 的局部放大圖。

圖4 大豆油脂樣品的THz 吸收譜Fig.4 THz absorption spectrum of soybean oil samples

圖5 隨機(jī)抽取樣品的THz 吸收譜及放大圖Fig.5 THz absorption spectra of randomly selected samples and magnification

由圖4 可知，樣品間的THz 吸收譜信號(hào)既有相似性又存在差異。隨著頻率的增加，大豆油脂樣品的吸收系數(shù)逐漸增加，且磷脂酸的含量越高，吸收系數(shù)越大，說明磷脂酸的存在提高了大豆油脂樣品對(duì)THz 波的吸收程度，這與Hao 等[26]和Huang 等[27]的研究結(jié)果一致。圖5a 更加清晰地展現(xiàn)了大豆油脂樣品的吸收譜圖，在0.4～1.5 THz 大豆油脂樣品的吸收譜線幾乎平穩(wěn)，沒有明顯的吸收峰，而在1.5～2.6 THz 內(nèi)出現(xiàn)了多個(gè)較顯著的吸收峰，且由圖5b 的局部放大圖可以看出，大豆油脂樣品在1.58 THz 處都出現(xiàn)了第1 個(gè)較為明顯的吸收峰，可作為其在太赫茲波段的指紋譜用于特征識(shí)別[28]。

2.2 數(shù)據(jù)處理及模型的建立

2.2.1 異常樣品的剔除 樣本制作及檢測(cè)過程中，由于儀器及人為誤差的影響，會(huì)使得樣本中存在一些異常樣品，在建模的過程中，會(huì)改變數(shù)據(jù)的整體分布，影響模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，為了提高模型的預(yù)測(cè)精度，首先將整體樣品中的異常樣品進(jìn)行剔除[29]。本試驗(yàn)采用PLS 對(duì)105 大豆油脂樣品建立PLS 數(shù)學(xué)模型，結(jié)果如圖6所示。

圖6 105 個(gè)樣本濃度殘差圖Fig.6 Residual plot of concentration for 105 samples

試驗(yàn)利用逐一剔除法進(jìn)行了異常樣品的剔除[30]。由圖6 可以看出，在105 個(gè)大豆油脂樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果中，64 號(hào)樣品較其它樣品的殘差相對(duì)較大，屬于奇異點(diǎn)，該樣品的存在影響了模型的整體預(yù)測(cè)結(jié)果，因此首先將其作為異常樣品進(jìn)行剔除。在剔除64 號(hào)異常樣品后，將剩余樣品進(jìn)行重新建模，再比較在樣品整體分布中誤差較大的點(diǎn)，進(jìn)而將該樣品作為奇異點(diǎn)進(jìn)行剔除。以此類推，每剔除一個(gè)或幾個(gè)奇異點(diǎn)后，均重新進(jìn)行建模，比較整體樣品中是否存在奇異點(diǎn)，直到最后一次建立的模型中，沒有誤差較大的樣品。最終確定了14 個(gè)奇異點(diǎn)，逐一剔除后，將剩余的91 個(gè)樣品進(jìn)行模型的建立。

2.2.2 樣品分集 輸入吸光度的頻率范圍為0.4～2.6 THz，將91 個(gè)樣品分為兩組進(jìn)行校正和預(yù)測(cè)，校正集樣品性質(zhì)需能夠涵蓋未知樣品的化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)校正集樣品的濃度變化范圍需大于未知樣品的濃度變化范圍，且化學(xué)值分布均勻等條件，預(yù)測(cè)集用來評(píng)估校正集所建立模型的精度[31]。要構(gòu)建一個(gè)可靠的模型，需要使用一半以上的樣品進(jìn)行校正，因此，本試驗(yàn)用73 個(gè)樣品作為校正集，18 個(gè)樣本作為預(yù)測(cè)集，具體的校正集和預(yù)測(cè)集樣品信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 校正集和預(yù)測(cè)集樣本信息統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistics of sample information of correction set and prediction set

由表1 可知，校正集的73 個(gè)樣品，磷脂酸含量為0.1417～1.9752 g/50 g，平均值在1.0532 g/50 g，可知校正集樣品磷脂酸含量適中，且分布在各個(gè)范圍內(nèi)的樣品個(gè)數(shù)比較均勻，保證了校正模型測(cè)量的精確度。預(yù)測(cè)集的18 個(gè)樣品，磷脂酸含量為0.2356～1.9501 g/50 g，平均值在1.0497 g/50 g，可知預(yù)測(cè)集樣品基本覆蓋了91 個(gè)大豆油脂樣品中較廣泛的磷脂酸的含量，可以使預(yù)測(cè)模型具有較好的準(zhǔn)確性和適用性。

2.2.3 基于PLS 模型的建立及預(yù)測(cè) 剔除奇異點(diǎn)后，采用經(jīng)典的PLS 法分別對(duì)未經(jīng)處理的原始光譜以及經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理后的譜圖建立磷脂酸含量的校正及預(yù)測(cè)模型[32]，結(jié)果見表2。

表2 校正模型和預(yù)測(cè)模型結(jié)果Table 2 Alibration model and prediction model results

由表2 可以看出，通過二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理后的預(yù)測(cè)集決定系數(shù)R2為0.9980，表明大豆油脂樣品中的磷脂酸含量與THz 吸收系數(shù)具有較高的相關(guān)性，預(yù)測(cè)集均方根誤差RMSEP 為0.0813，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為8.16%，模型相關(guān)系數(shù)較大，誤差在允許范圍內(nèi)，所建模型穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性可靠[33]，經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)處理后的光譜預(yù)測(cè)模型如圖7所示。

由圖7 可以看出，樣品的數(shù)值點(diǎn)比較均勻地分布在直線的兩側(cè)，建模效果良好，二階導(dǎo)數(shù)去除了與波長(zhǎng)相關(guān)的漂移，有效提高了模型的精度，表明經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理后的太赫茲光譜建立的PLS模型適用于定量檢測(cè)模擬脫膠大豆毛油中磷脂酸含量。

圖7 二階導(dǎo)數(shù)光譜預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 Prediction results of the second derivative spectrum

3 結(jié)論

本文制得不同磷脂酸含量的大豆油脂樣品，并精確測(cè)定了大豆油脂樣品中磷脂酸的含量。采集了樣品的太赫茲時(shí)域譜，利用傅里葉變換將太赫茲時(shí)域譜轉(zhuǎn)換為頻域譜，然后通過光學(xué)參數(shù)計(jì)算得出太赫茲吸收譜。THz 波產(chǎn)生了不同程度的延遲，樣品中磷脂酸的含量越高，頻域譜的幅值越低，吸收系數(shù)也越大，特征吸收峰明顯，可用于大豆油中磷脂酸的特征識(shí)別。

利用PLS 對(duì)剔除異常樣本后的91 個(gè)樣品建立了磷脂酸含量與樣品吸收譜之間的定量分析模型，其中原始光譜和經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)處理后的模型R2較小，RMSEP 和RSD 較大，而經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理后光譜模型的R2較大，RMSEP 較小，RSD 低于10%，表明利用太赫茲光譜可以檢測(cè)大豆油中的磷脂酸含量，為太赫茲光譜快速分析檢測(cè)大豆毛油中的殘磷量提供理論依據(jù)。