牛付閣，周 娛，張秋萍，喻 嬌，杜藝軒，潘偉春

（浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州310018）

食品的眾多性質(zhì)，如感官、質(zhì)感乃至其在體內(nèi)的消化吸收，都和其結構緊密相關[1-2]。該食品的結構的尺度從宏觀開始，跨越介觀，直到納米尺度的微觀。和其它測試結構的技術相比，機械流變存在以下優(yōu)點：測量設備相對簡單，試驗條件可控度高，能原位測試，測量結果是系統(tǒng)的平均行為，對應的基礎理論成熟，因此，機械流變是研究食品以及其它高分子體系相互作用及各種結構的重要手段[3]。然而，食品中存在一類結構，如蛋白簇[4]，它非常脆弱，很容易被外力破壞，這限制了該技術在食品中的應用?？紤]到該類結構在食品中廣泛存在，如酸奶、溶液乳化過程等，因此催生一種新的流變學技術--微流變技術（Micro rheology）[5-7]。除了繼承機械流變的優(yōu)點外，該技術還有用量少，速度快，可重復性高，沒有外加力對食品部分弱結構造成影響，測量頻率范圍廣等優(yōu)點[8-10]。

微流變技術是通過測量小顆粒（直徑約1 μm）[11]在所測量體系中的布朗運動，通過廣義Stokes-Einstein 關系式，來估算體系的流變學的相關參數(shù)。這些小顆粒被命名為示蹤粒子，常見的示蹤粒子既可以是體系本身所含的顆粒，也可以是高分子膠體粒子[12-14]。由于顆粒大小能顯著影響微流變技術所得結果，結構清晰的高分子膠體顆粒受到了研究者的青睞。由于微流變測量中，顆粒的布朗運動為熱量所驅動，示蹤粒子在體系中運動時，除了受到周圍環(huán)境純流體力學的拖曳力外，應不存在其它相互作用影響粒子運動。示蹤粒子的尺度應小于體系中網(wǎng)格（如存在的話）的尺寸，同時示蹤粒子可以用硬球模型來表示，即示蹤粒子和體系中其它成分不存在相互作用。

隨著微流變技術的普及，一些食品科學工作者開始使用該技術。有些使用者在應用的過程中對上述的要求不清晰，特別是容易忽略膠體粒子的表面性質(zhì)以及與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，使獲得的微流變信息與真實值具有一定差距。解決這一問題的關鍵是將體系中添加的粒子與蛋白之間的相互作用進行建模，選擇一個合適、簡單且有效的模型研究體系的微流變行為。

在研究過程中，溶液體系的黏度是影響測量結果的一個重要指標[15-16]。然而，研究者往往會忽略黏度的校正，造成測量結果偏離真實值。黏度法是檢測蛋白分子構象及溶液性質(zhì)的最基本的方法之一[17-18]。目前國內(nèi)利用微觀流變學研究蛋白溶液黏度的報道不多。本文將不同的蛋白質(zhì)與不同的膠體粒子之間的相互作用作為切入點，利用動態(tài)光散射技術建立一種有效的微觀測量溶液體系黏度的方法，為復雜食品體系的微流變研究提供理論依據(jù)，為食品加工過程中蛋白質(zhì)的開發(fā)和利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

三羥甲基氨基甲烷（Tris），購于國藥集團化學試劑有限公司；聚苯乙烯微球（A）與聚苯乙烯-羧基微球（B），購于蘇州智微納米科技有限公司；聚苯乙烯微球（C）、牛血清蛋白（BSA）（Lot #WXBC5159V）、溶菌酶（lys）（Lot # SLBJ4107V）、β-乳球蛋白（BLG）（Lot # SLBS6536）、卵白蛋白OVA（Lot # SLBQ9036V）等，均購于Sigma 公司。

1.2 樣品制備

配制1 000 mL，20 mmol/L，pH=7.4 Tris-HCl緩沖液，放入4 ℃冰箱備用。準確稱取0.4 g 的BSA、BLG、lysozyme 3 種蛋白質(zhì)，用Tris-HCl 緩沖液分別溶解。使最終蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL。稱取0.1 g OVA，用Tris-HCl 緩沖液溶解，使最終蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL。為了使蛋白原始溶液充分水化溶解，將配好的4 種蛋白溶液分別放置在磁力攪拌器中攪拌2 h，攪拌速度為150 r/min，之后將溶液放置于4 ℃冰箱保存24 h。將放置24 h 后的4 種蛋白原始溶液用Tris-HCl 稀釋2～10倍5 個濃度梯度至10 mL，備用。

1.3 動態(tài)光散射（DLS）測定

動態(tài)光散射技術通過Stokes-Einstein 方程變形得到方程（1），通過測量體系中球形顆粒的平移擴散系數(shù)來計算顆粒粒徑和液體黏度[19-22]。

式中：η——溶劑的黏度，mPa·s；κB——波爾茨曼常數(shù)，J/K；T——溫度，K；R——水力學半徑，nm；D——擴散系數(shù)，cm2/s。

分散的膠體粒子在液體中做無規(guī)則布朗運動時，在固定散射角θ 處觀測到的散射光光強Ι（t）隨時間漲落，相關時間的指數(shù)衰減函數(shù)如下：

方程（2）中：Ι（t）——散射光光強；τ——衰減時間，ms。衰減時間τ 與表征體系中粒子的集體布朗運動平移擴散系數(shù)D有如下關系：

式中：q——散射矢量，cm-1；n——樣品折射率；λ0——光在真空中的波長，nm；θ——散射角，°。將（3）式帶入（1）式得到最終黏度計算公式為：

式中：η——溶劑的黏度，mPa·s；κB——波爾茨曼常數(shù)，J/K；T——溫度，K；τ——衰減時間，ms；R——水力學半徑，nm。

分別取2.5 mL Tris-HCl 緩沖液，快速經(jīng)過0.22 μm 的濾膜（水膜）過濾后，緩慢滴入3 個已經(jīng)由丙酮淋洗干凈的光散射專用測量瓶中，用移液槍取2 μL 3 種不同膠體粒子分別加入Tris-HCl緩沖液中，輕輕搖勻使膠體粒子充分分散在體系中避免氣泡給試驗帶來干擾，等待測量。

取2.5 mL 稀釋好的不同濃度梯度的蛋白溶液，快速經(jīng)過0.22 μm 的親水濾膜，放入已經(jīng)由丙酮淋洗干凈的光散射專用測量瓶中。重復3 次，在相同濃度蛋白溶液測試樣品中，分別用移液槍精確滴入2 μL 3 種膠體粒子（A，B，C），輕輕搖晃光散射瓶子30 s，使膠體粒子充分分散在溶液中。所測量的每種蛋白有15 個樣品，所有樣品均操作相同，清楚標記每個樣品名稱。

本試驗選擇的測量波長為632.8 nm，測量角度為90°，測量溫度為25 ℃，測量時間為30 s，每個樣品重復測量10 次。

1.4 膠體粒子zata 電位測定

取3 個試管，分別加入3 mL Tris-HCl 緩沖液，用移液槍取2 μL 3 種不同膠體粒子分別加入到3 個試管溶液中搖晃，使膠體粒子充分分散到溶液中，取樣加入到樣品池中25 ℃等待測量。樣品測試前在儀器中平衡60 s，設定蛋白模式程序，每組運行11 次，運行3 組，結果為多次測試的平均值。

1.5 均方旋轉半徑Rg 的測定

在25 ℃下，將動態(tài)光散射所制備的樣品放入樣品瓶，利用光散射儀對BSA，BLG，lys 3 種蛋白與3 種粒子做靜態(tài)光散射分析。測試角度范圍為30°～60°，2°為一個梯度，測試誤差為5%，測試時間為30 s，測試中入射光強保持不變，待測樣品平行測定3 次。

2 結果與討論

2.1 蛋白質(zhì)與膠體粒子動態(tài)光散射自相關函數(shù)分析

圖1a 是A，B，C 3 種不同膠體粒子分散到Tris-HCl 緩沖液的自相關函數(shù)，它們尺寸不同，其中，膠體粒子B 表面接有羧基基團。可以看出這3種膠體粒子相關函數(shù)均沿弛豫時間軸快速移動到較短時間，說明這3 種膠體粒子本身均一性較好，粒徑均呈單峰分布且較集中，沒有發(fā)生聚集現(xiàn)象，可以排除膠體粒子本身對試驗準確性造成的干擾。

可以從圖1b 看出膠體粒子C 分散的溶液體系中自相關函數(shù)沿著弛豫時間并沒有快速移動，且相關函數(shù)沒有衰減到0，粒徑呈多峰分布。說明在膠體粒子C 存在的體系中，lys 與膠體粒子C 發(fā)生強相互作用，發(fā)生較為嚴重的聚集現(xiàn)象且有大顆粒產(chǎn)生。所以，使用膠體粒子C 測蛋白黏度所得到的黏度值與真實值有偏差。從圖1c、1d 可以看出BSA 和BLG 體系的自相關函數(shù)沿著弛豫時間均快速移動到較短時間，并且相關函數(shù)都能衰減到0，粒徑分布峰寬較窄且集中。說明BLG 和BSA與3 種膠體粒子之間均沒有發(fā)生強相互作用產(chǎn)生大顆粒。而且整體來看，蛋白濃度的改變對粒子間相互作用影響不大。

圖1 蛋白質(zhì)在3 種膠體粒子體系中的弛豫時間分布圖Fig.1 Dynamic light scattering attenuation curve of proteins in three colloidal particle systems

2.2 膠體粒子Zeta 電位值測定分析

由于膠體粒子C 與lys 混合體系存在大顆粒，為了進一步探究膠體粒子與蛋白之間的相互作用，本試驗測定了3 種膠體粒子單一分散體系的Zeta 電位值。從圖2 中可以看出，A，B，C 3 種膠體粒子均帶負電，并且A 與B 所帶負電荷明顯少于C，而蛋白溶液所處環(huán)境pH 值為7.4，在此條件下，BSA（pI=4.7），BLG（pI=5.2），OVA（pI=4.7），3種蛋白表面均帶大量負電荷，因此與膠體粒子之間沒有較強的靜電荷相互吸引作用。而lys 的等電點pI=11.35 高于7.4，蛋白表面會帶較多正電荷，因而會與膠體粒子C 發(fā)生較強的靜電相互吸引作用，甚至產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。這也解釋了1 中的試驗現(xiàn)象。因此在后續(xù)lys 體系黏度測量時，我們選擇了A 與B 兩種膠體粒子。

圖2 3 種膠體粒子A，B，C Zeta-電位值Fig.2 The Zeta-potential values of colloidal particles（A，B，C）

2.3 膠體粒子Rg 測定分析

為了進一步說明液體分散體系中蛋白與膠體粒子之間是否存在強相互作用，確保動態(tài)光散射測量蛋白黏度的可靠性，我們利用靜態(tài)光散射測量了旋轉半徑Rg[23-25]。通過監(jiān)測Rg 隨蛋白濃度梯度的變化，進一步證實所測結果的變化是由粒子間相互作用減弱所致還是由顆粒本身的幾何形狀變化所致。

通過圖3 可以看出，膠體粒子分散在緩沖液中測得的Rg 和分散到蛋白溶液中測得的Rg 相比沒有顯著性差異。只有在BLG 與膠體粒子B 的體系中，Rg 隨蛋白濃度改變出現(xiàn)輕微變化。從整體來看，蛋白濃度這一因素對粒子之間的相互作用沒有較大影響。

圖3 蛋白-膠體粒子混合體系的Rg 變化Fig.3 Rg change of protein-colloidal particle hybrid system

2.4 lys-膠體粒子體系黏度測定

為了驗證動態(tài)光散射測量溶液黏度方法的可行性，首先在水溶液中加入粒徑不同的膠體粒子測定純水的黏度[27]。其次為了避免緩沖液對黏度的影響，在Tris-HCl 緩沖液中加入3 種膠體粒子測定了緩沖液黏度。結果顯示緩沖液與純水黏度差異不大，說明緩沖液對黏度測量基本無影響。

表1 水的黏度測定（25 ℃）Table 1 Determination of viscosity of water（25 ℃）

可以從圖4 看出，lys 蛋白溶液的黏度隨著蛋白濃度的增加有輕微上升趨勢?？赡苁怯捎趌ys 在較低濃度時對于蛋白黏度影響較小，蛋白溶液分子內(nèi)和分子之間的氫鍵作用比較弱。為了進一步證明測得溶液黏度值真實有效，本試驗結合宏觀流變測定了溶液黏度，如表3所示。通過將微觀與宏觀測得的黏度值進行顯著性分析，發(fā)現(xiàn)A 與B得到的lys 黏度特性沒有明顯差異，說明A，B 均可適用于lys 黏度的測定。從以上結果可以初步得出，膠體粒子的粒徑對lys 蛋白表觀黏度測定影響較小。

表2 Tris-HCl 緩沖液的黏度測定（25 ℃，pH 7.4）Table 2 Viscosity determination of Tris-HCl buffer（25 ℃，pH 7.4）

表3 10 mg/mL lys 宏觀與微觀黏度結果（25 ℃，pH 7.4）Table 3 Macroscopic and microscopic viscosity results of 10 mg/mL lys（25 ℃，pH 7.4）

圖4 不同膠體粒子與質(zhì)量濃度下lys 黏度特性（25 ℃，pH 7.4）Fig.4 The viscosity characteristics of different concentration of lys with different colloidal particles（25 ℃，pH 7.4）

2.5 BLG-膠體粒子體系黏度測定

如圖5所示，在膠體粒子A 分散的BLG 蛋白溶液體系中，BLG 溶液黏度隨蛋白濃度提高有極小上升趨勢，可能是由于分子間的引力沒有明顯變化。而B 與C 膠體粒子分散的體系中，在蛋白濃度較低時黏度趨勢不變，而隨著蛋白濃度進一步提高，蛋白表觀黏度也有微小上升趨勢，可能是由于蛋白溶液分子內(nèi)的氫鍵作用增強從而引起黏度的增加。用宏觀流變的方法測得溶液的黏度如表4所示。通過比較宏觀與微觀的黏度值，發(fā)現(xiàn)膠體粒子C 分散的溶液黏度與宏觀測得的黏度差距最小，說明動態(tài)光散射利用膠體粒子所測得的黏度是真實有效的，其中膠體粒子C 與BLG 相互作用最弱，膠體粒子C 更適宜微觀測黏度。

圖5 不同膠體粒子與質(zhì)量濃度下BLG 黏度特性（25 ℃，pH 7.4）Fig.5 The viscosity characteristics of different concentration of BLG with different colloidal particles（25 ℃，pH 7.4）

表4 8 mg/mL BLG 宏觀與微觀黏度結果（25 ℃，pH 7.4）Table 4 Macroscopic and microscopic viscosity results of 8 mg/mL BLG（25 ℃，pH 7.4）

2.6 BSA-膠體粒子體系黏度測定

圖6 顯示隨著蛋白濃度的提高，蛋白溶液黏度有所波動。膠體粒子B 分散的體系中，隨蛋白濃度的提高，蛋白溶液黏度有輕微上升趨勢。膠體粒子C 分散的體系中，同BLG 一樣，在較低濃度時蛋白溶液黏度沒有隨蛋白濃度提高而發(fā)生明顯變化，而在蛋白濃度較高時，蛋白溶液黏度有輕微上升趨勢。如表5所示，結合宏觀測得的黏度進行顯著性分析，可以看出pH 7.4 條件下，膠體粒子A，B，C 均適宜測量BSA 溶液黏度。

表5 10 mg/mL BSA 宏觀與微觀黏度結果（25 ℃，pH 7.4）Table 5 Macroscopic and microscopic viscosity results of 10 mg/mL BSA（25 ℃，pH 7.4）

圖6 不同膠體粒子與質(zhì)量濃度下BSA 黏度特性（25 ℃，pH 7.4）Fig.6 The viscosity characteristics of different concentration of BSA with different colloidal particles（25 ℃，pH 7.4）

2.7 OVA-膠體粒子體系黏度測定

如圖7所示，隨著濃度的提高，OVA 溶液黏度有所波動，整體趨于穩(wěn)定，可能是由于蛋白濃度過低，蛋白分子間的氫鍵作用較弱導致黏度沒有顯著變化。結合表6，膠體粒子B 微觀測得的黏度與宏觀無顯著性差異。因此，通過DLS 選擇合適的膠體粒子微觀測得的黏度值可以信賴。可能對微觀測量結果造成偏差的主要原因有：1）顆粒團聚，本研究在試驗前均將分散體系充分搖晃，但即便如此，也無法保證顆粒在分散體系中不會出現(xiàn)顆粒團聚現(xiàn)象。2）顆粒在待測液體樣品中可能存在分布不均勻的情況，局部顆粒濃度過高可能會導致多重散射的現(xiàn)象。

圖7 不同膠體粒子與質(zhì)量濃度下OVA 黏度特性（25 ℃，pH 7.4）Fig.7 The viscosity characteristics of different concentration of OVA with different colloidal particles（25 ℃，pH 7.4）

表6 5 mg/mL OVA 宏觀與微觀黏度結果（25 ℃，pH 7.4）Table 6 Macroscopic and microscopic viscosity results of 5 mg/mL OVA（25 ℃，pH 7.4）

3 結論

本文利用光散射技術監(jiān)測蛋白-膠體粒子體系的相互作用，優(yōu)化了一種有效的微觀測定溶液黏度的方法，增加了研究蛋白分子構象及溶液性質(zhì)的另一個維度。結果表明，膠體粒子的粒徑和蛋白濃度均對粒子間的相互作用影響較小，而膠體粒子與蛋白質(zhì)表面帶電性質(zhì)卻顯著影響分子間的相互作用，且對體系黏度測定也有較大影響。因此利用黏度測定的方法監(jiān)測分子間的相互作用是可行的。此外，比較宏觀與微觀測得的黏度值，發(fā)現(xiàn)表面接有羧基的膠體粒子在測量溶液黏度時適用性較高。這也說明了DLS 微觀測得的黏度值是真實有效的，且DLS 測量蛋白溶液黏度具有顯著的優(yōu)勢。