李 俠，溫佳琪，王秀娟，宋雨齊，代偉長(zhǎng)，王玉華

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長(zhǎng)春130118）

蛋源受母禽生殖道及生產(chǎn)環(huán)境的污染，表面帶有大量微生物，如未經(jīng)處理則在打蛋過(guò)程中會(huì)污染蛋液[1]。雖然灌裝后會(huì)對(duì)液蛋制品進(jìn)行殺菌處理，但是，應(yīng)用目前蛋液最佳殺菌方式——超高溫巴氏殺菌法（74 ℃，60～120 s）處理后，蛋液中仍有大量微生物存活。由于前期蛋液殺菌不徹底，大量微生物污染，會(huì)導(dǎo)致后期殺菌難度大，殺菌效果差，因此影響液蛋制品質(zhì)量和保質(zhì)期。蛋源表面的微生物種類(lèi)繁多，常見(jiàn)的微生物有大腸桿菌屬（Escherichia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、變形桿菌屬（Proteus）、產(chǎn)氣單胞菌屬（Aeromonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、沙門(mén)氏菌屬（Salmonella）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、副大腸桿菌屬（Para escherichia）等[2-4]。特別是輸卵管帶菌家禽所產(chǎn)蛋，70%為帶菌蛋，所帶微生物為雞白痢沙門(mén)氏菌（SalmonellaPullorum）、雞副傷寒沙門(mén)氏菌（SalmonellaParatyphi）及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等[5-7]。此外，還可能存在一些不可培養(yǎng)的微生物，特別是致病菌，如霍亂弧菌（Vibrio cholerae）和大腸埃希氏菌（Escherichia coli）可以活的狀態(tài)存在，這些微生物種類(lèi)繁多，可能存在潛在危害[8]。鑒于此，對(duì)蛋源表面微生物進(jìn)行處理具有重要意義。

目前常用的蛋源物理消毒方法有巴氏消毒法、熱風(fēng)消毒法和紫外線(xiàn)消毒法[9-11]?；瘜W(xué)劑消毒法常見(jiàn)的消毒劑主要有氯消毒劑、高錳酸鉀、過(guò)氧乙酸等。物理消毒方法所需時(shí)間長(zhǎng)，耗能高，導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)成本高[12]。消毒劑中次氯酸鈉、二氧化氯[13]、氫氧化鈉、碳酸鈉殺菌效果雖好，但殺菌時(shí)間長(zhǎng)，工業(yè)生產(chǎn)中受到極大限制[14-15]。雞蛋表面微生物種類(lèi)繁多[16]，利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法雖能檢出常見(jiàn)食品致病菌，但并不能準(zhǔn)確檢出所有菌，且耗時(shí)、耗力。將宏基因組學(xué)技術(shù)[17]應(yīng)用于蛋殼表面微生物多樣性的分析，可準(zhǔn)確分析微生物種類(lèi)，為后期蛋源前處理方法的優(yōu)化研究奠定基礎(chǔ)。本文比較不同物理、化學(xué)和物理化學(xué)協(xié)同消毒方法對(duì)蛋源表面微生物的作用效果，確定最佳蛋源前處理方法。采用宏基因組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析消毒處理前、后蛋殼表面菌群多樣性，為提升液蛋制品的品質(zhì)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

當(dāng)日產(chǎn)新鮮雞蛋，來(lái)自二商集團(tuán)有限責(zé)任公司。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（VRBA）、緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基（BS），北京奧博星生物技術(shù)有限公司；次氯酸鈉、過(guò)氧乙酸（A、B 液）、二氧化氯（均為食品級(jí)），北京化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GS-20G-1 高速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；MDF-382E 冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DHG-9146 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AHWY-200B 超低溫冰箱，日本三洋公司；CE09001 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器有限公司；Infinile M200 多功能酶標(biāo)儀，TECAN。

1.3 不同處理方法對(duì)蛋殼表面菌落總數(shù)的影響

1.3.1 次氯酸鈉消毒法對(duì)蛋殼表面菌落總數(shù)的影響 將每10 枚新鮮雞蛋分別浸泡在質(zhì)量濃度為50，100，150，200，250 mg/L 的次氯酸鈉消毒劑中5，10，15 min，按照GB 4789.2-2016 方法測(cè)定消毒后蛋殼表面微生物菌落總數(shù)，每組平行3 次。

1.3.2 二氧化氯消毒法對(duì)蛋殼表面菌落總數(shù)的影響 將每10 枚新鮮雞蛋分別浸泡在質(zhì)量濃度為25，50，75，100，125 mg/L 的二氧化氯消毒劑中5，10，15 min，按照GB 4789.2-2016 方法測(cè)定消毒后蛋殼表面微生物菌落總數(shù)，每組平行3 次。

1.3.3 過(guò)氧乙酸消毒法對(duì)蛋殼表面菌落總數(shù)的影響 將每10 枚新鮮雞蛋分別浸泡在質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50 mg/L 的過(guò)氧乙酸消毒劑中5，10，15 min，按照GB 4789.2-2016 方法測(cè)定消毒后蛋殼表面微生物菌落總數(shù)，每組平行3 次。

1.3.4 紫外線(xiàn)輻射消毒法對(duì)蛋殼表面菌落總數(shù)的影響 將每10 枚新鮮雞蛋分別距紫外線(xiàn)燈10，20，30 cm，照射5，10，15 min，按照GB 4789.2-2016 方法測(cè)定消毒后蛋殼表面微生物菌落總數(shù)，每組平行3 次。

1.3.5 巴氏殺菌消毒法對(duì)蛋殼表面菌落總數(shù)的影響 將每10 枚新鮮雞蛋分別在60，65，70 ℃溫度下處理2.5，3，3.5 min，按照GB 4789.2-2016 方法測(cè)定消毒后蛋殼表面微生物菌落總數(shù)，每組平行3 次。

1.3.6 物理化學(xué)協(xié)同消毒法 將上述5 種方法中最優(yōu)濃度組分別在60，65，70 ℃的無(wú)菌水中處理30，60，90，120 s，按照GB 4789.2-2016 方法測(cè)定消毒后蛋殼表面菌落總數(shù)，每組平行3 次。

1.4 微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)

對(duì)前處理后的蛋源表面菌落總數(shù)、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及沙門(mén)氏菌數(shù)按照GB 4789.2-2016、GB 4789.3-2016、GB 4789.10-2016 和GB 4789.4-2016 方法進(jìn)行檢驗(yàn)，平行3 次，對(duì)照組為未經(jīng)前處理蛋源。

1.5 蛋源表面微生物多樣性分析

1.5.1 樣品的采集 隨機(jī)取樣當(dāng)日產(chǎn)出新鮮雞蛋和經(jīng)物理化學(xué)協(xié)同消毒法處理后的雞蛋，用滅菌生理鹽水棉拭子均勻擦拭蛋殼表面，每組樣品50枚雞蛋，取樣后，-80 ℃冷凍保存，備用。

1.5.2 多樣性分析 通過(guò)Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)前處理后蛋源表面微生物16SrRNA 基因的高度可變區(qū)V3 和V4 進(jìn)行測(cè)序，并根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物多樣性分析，每個(gè)組5 個(gè)平行樣品。試驗(yàn)流程為：蛋殼表面微生物總DNA 提取→目標(biāo)片段PCR 擴(kuò)增→擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化→擴(kuò)增產(chǎn)物熒光定量→測(cè)序文庫(kù)制備→上機(jī)進(jìn)行高通量測(cè)序。通過(guò)操作分類(lèi)單元（OTU）對(duì)獲得的序列進(jìn)行分類(lèi)，并且通常使用97%的序列相似度作為OTU 分區(qū)閾值，其等于分類(lèi)中的物種水平。根據(jù)不同樣品中OTU 的豐度分布，評(píng)價(jià)每個(gè)樣品的多樣性水平，并使用稀疏曲線(xiàn)或物種積累曲線(xiàn)反映測(cè)序深度是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。分析不同分類(lèi)水平的各地區(qū)微生物的具體組成。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Origin2017、GraphPad Prism 7.0 軟件和Excel 2007 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、計(jì)算、統(tǒng)計(jì)與分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋源消毒前處理方法比較與優(yōu)化

2.1.1 化學(xué)前處理方法 采用不同濃度的過(guò)氧乙酸、次氯酸鈉和二氧化氯處理雞蛋，觀(guān)察蛋殼表面微生物的變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1a 為不同濃度、不同處理時(shí)間過(guò)氧乙酸處理后蛋殼表面微生物殘留的結(jié)果。由圖可知，隨著過(guò)氧乙酸濃度與處理時(shí)間的增加，處理效果隨之變好，其中50 mg/L，15 min 效果最顯著（P<0.01）。經(jīng)過(guò)其殺菌處理后的蛋殼表面微生物數(shù)量由6.08 lg（CFU/個(gè)）降低為3.30 lg（CFU/個(gè)），殺菌率達(dá)到99.7%；圖1b 為不同濃度、不同處理時(shí)間次氯酸鈉處理后蛋殼表面微生物殘留的結(jié)果。由圖可知，隨著次氯酸鈉濃度與處理時(shí)間的增加，處理效果隨之變好，其中250 mg/L，15 min 效果最顯著（P<0.01）。經(jīng)過(guò)其殺菌處理后的蛋殼表面微生物數(shù)量由6.08 lg（CFU/個(gè)）降低為3.27 lg（CFU/個(gè)），殺菌率達(dá)到99.7%；圖1c 為不同濃度不同處理時(shí)間二氧化氯處理后蛋殼表面微生物殘留的結(jié)果。由圖可知，隨著二氧化氯濃度與處理時(shí)間的增加，處理效果隨之變好，其中125 mg/L，15 min 效果最顯著（P<0.01）。經(jīng)過(guò)其殺菌處理后的蛋殼表面微生物數(shù)量由6.08 lg（CFU/個(gè)）降低為1.82 lg（CFU/個(gè)），殺菌率達(dá)到99.8%。

由此可知，在殺菌率上，3 種消毒劑基本保持一致，但考慮到操作難易程度、消毒劑保存以及價(jià)格等綜合因素，由于二氧化氯更易保存，操作簡(jiǎn)便，因此，將二氧化氯前處理作為更優(yōu)質(zhì)的前處理方法。

2.1.2 物理前處理方法 圖2 為兩種物理前處理方法，其中圖2a 為不同溫度對(duì)蛋源表面處理結(jié)果，隨著溫度的升高，蛋源表面的菌落總數(shù)逐漸降低，當(dāng)處理?xiàng)l件為70 ℃，3.5 min 時(shí)，殺菌效果最好，殺菌率為99.7%，但此時(shí)蛋液發(fā)生了少量凝固，因此，此條件下的前處理不宜作為蛋源的前處理方法。但由于高溫殺菌效果良好，可以考慮適當(dāng)?shù)乜s短高溫處理時(shí)間，并與化學(xué)劑法相結(jié)合，在保證蛋液不發(fā)生凝固的情況下，既降低處理時(shí)間，又提高殺菌率；圖2b 為不同高度紫外線(xiàn)對(duì)蛋源表面處理后菌落總數(shù)變化結(jié)果，其中處理效果最好的為距紫外燈10 cm，處理15 min，但其殺菌率僅為91.0%，因此不作為前處理方法。

圖2 不同物理法前處理后蛋殼表面的細(xì)菌總數(shù)變化Fig.2 Changes in the total number of bacteria on the surface of the eggshell after different physical methods

2.1.3 二氧化氯協(xié)同加熱前處理對(duì)蛋殼表面菌落總數(shù)的影響 在圖1 中可知，質(zhì)量濃度為125 mg/L 的二氧化氯處理15 min 的殺菌效果最好，但在工業(yè)生產(chǎn)中，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低生產(chǎn)效率，增加生產(chǎn)成本。因此，選擇二氧化氯質(zhì)量濃度為125 mg/L，處理5 min 基礎(chǔ)上，分別結(jié)合60，65 和70 ℃熱水清洗30，60，90，120 s，對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，觀(guān)察蛋殼表面菌落總數(shù)的變化。

圖1 不同濃度的化學(xué)劑前處理后蛋殼表面的細(xì)菌總數(shù)變化Fig.1 Changes in total number of bacteria in eggshells after pretreatment with different concentrations of chemicals

由圖3 可知，隨著水溫升高與處理時(shí)間的增加，菌落總數(shù)顯著下降（P<0.05）。65 ℃處理120 s、70 ℃處理90，120 s 效果最好，殺菌率分別為99.9%，99.6%和99.9%。65 ℃處理120 s 和70 ℃處理120 s 殺菌率均超過(guò)了125 mg/L 二氧化氯處理15 min 的殺菌率。但將前處理后的雞蛋進(jìn)行打蛋后發(fā)現(xiàn)，70 ℃處理120 s 后蛋清出現(xiàn)少量凝固，溫度過(guò)高的條件下長(zhǎng)時(shí)間處理使蛋清蛋白質(zhì)發(fā)生變性。因此65 ℃處理120 s 為最佳的處理?xiàng)l件，最佳蛋源前處理?xiàng)l件為先用125 mg/L 的二氧化氯浸泡5 min 后，再用65 ℃熱水處理120 s。

圖3 二氧化氯結(jié)合加熱前處理后蛋殼表面的細(xì)菌總數(shù)的變化Fig.3 Changes in total number of bacteria in eggshell after pretreatment at different temperatures

2.2 二氧化氯結(jié)合加熱前處理對(duì)蛋源表面菌群多樣性的影響

2.2.1 前處理后蛋源表面菌群Alpha 多樣性分析

二氧化氯協(xié)同加熱前處理后蛋源表面微生物多樣性稀疏曲線(xiàn)如圖4所示，橫坐標(biāo)表示每個(gè)樣品中隨機(jī)抽取序列的總數(shù)；縱坐標(biāo)表示在相應(yīng)深度處觀(guān)察到的OTU 的數(shù)量。曲線(xiàn)的長(zhǎng)度反映了樣品測(cè)序的數(shù)量。曲線(xiàn)的漸變程度反映了測(cè)序深度對(duì)觀(guān)察樣品多樣性的影響，曲線(xiàn)趨于平坦，表明測(cè)序結(jié)果足以反映當(dāng)前樣品的多樣性。由圖可知，隨著樣品量的不斷增加，當(dāng)其大于5 000 時(shí)，OTU 數(shù)趨于平緩，說(shuō)明對(duì)照組和前處理組的測(cè)序數(shù)據(jù)都足夠反映樣本中所包含的微生物多樣性。

圖4 前處理后蛋源表面菌群稀疏曲線(xiàn)Fig.4 The rarefaction curve of the surface flora of the egg source after pretreatment

圖5 為二氧化氯協(xié)同加熱前處理后蛋殼表面微生物群落Alpha 多樣性的4 種指數(shù)。如圖可知，經(jīng)過(guò)消毒前處理后的蛋殼表面微生物4 項(xiàng)Alpha 多樣性指數(shù)均顯著降低，說(shuō)明經(jīng)過(guò)前處理后蛋殼表面微生物的群落豐富度及群落多樣性都顯著降低（P<0.01），前處理對(duì)降低微生物的群落豐富性及多樣性均起到顯著效果。

圖5 前處理后蛋源表面菌群Alpha 多樣指數(shù)的影響Fig.5 Effect of alpha diversity index of microbiota of pre-treatment egg surface

表1 為二氧化氯協(xié)同加熱前處理前、后蛋源表面各分類(lèi)水平的微生物類(lèi)群數(shù)統(tǒng)計(jì)表，由表可知，經(jīng)前處理后的蛋源微生物門(mén)水平OTU 由19降至4；綱水平OTU 由27 降至6；目水平OTU 由49 降至10；科水平OTU 由94 降至16；屬水平OTU 由258 降至29；種水平OTU 由133 降至26。由此可見(jiàn)，消毒前處理雖然未達(dá)到100%的消毒效果，但顯著降低了蛋源表面的微生物豐富度。

表1 前處理后蛋源表面各分類(lèi)水平的微生物類(lèi)群數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of microbial groups at different levels of egg source surfaces after pretreatment

2.2.2 前處理后菌群分類(lèi)學(xué)組成變化 根據(jù)OTU劃分和分類(lèi)地位鑒定，可以獲得每個(gè)樣本在門(mén)、綱、目、科和屬分類(lèi)水平的具體組成信息。在本研究中，選擇門(mén)和屬這兩個(gè)水平，對(duì)二氧化氯協(xié)同加熱處理前、后蛋源微生物菌群的變化進(jìn)行分析。

圖6 為二氧化氯協(xié)同加熱前處理后蛋源微生物在門(mén)水平下組成的變化。經(jīng)前處理后，蛋源表面的厚壁菌門(mén)（Firmicutes）豐度由24.45%增長(zhǎng)為98.38%；變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）豐度分別由8.62%，49.28%降低為1.49%和0.18%。消毒處理前存在的擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），異常球菌-棲熱菌門(mén)（Deinococcus-Thermus）、藍(lán)藻門(mén)（Cyanobacteria）以及緑彎菌門(mén)（Chloroflex）等菌門(mén)均由于消毒前處理而殺菌徹底。此時(shí)，前處理后的蛋源表面微生物在門(mén)水平下僅有厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）。這表明二氧化氯協(xié)同加熱前處理方法有效地降低了蛋源表面微生物豐富度，而目前可見(jiàn)的前處理后的微生物豐度是樣品經(jīng)過(guò)增菌處理后所呈現(xiàn)的，因此，可以說(shuō)明二氧化氯協(xié)同加熱前處理殺菌效果顯著。

圖6 前處理后蛋源表面基于門(mén)水平的微生物分析Fig.6 Microbial analysis of egg source surface based on phylum level after pretreatment

如圖7所示，二氧化氯結(jié)合加熱處理前后蛋源微生物中豐度最高的15 個(gè)屬的變化情況。對(duì)照組蛋源豐度最高的15 個(gè)屬中，屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的為：芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭菌屬（Clostridium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、不可培養(yǎng)的和巨型球菌屬（Macrococcus）；屬于放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）的為：短狀桿菌屬（Brachybacterium）、考克氏菌屬（Kocuria）、棒狀桿菌屬1（Coynebacterium_1）、微球菌屬（Micrococcus）、羅思氏菌屬（Rothia）和鳥(niǎo)氨酸球菌屬（Ornithinimicrobium）；屬于變形菌門(mén)（Proteobacteria）的為：不動(dòng)桿菌屬（Acinetobbacter）、副球菌屬（Paracoccus）；此外，金黃桿菌屬（Chryseobacterium）屬于擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）；異常球菌屬（Deinococcus）屬于異常球菌-棲熱菌門(mén)（Deinococcus-Thermus）。經(jīng)過(guò)二氧化氯結(jié)合加熱前處理后，蛋源表面芽孢桿菌屬、梭菌屬豐度顯著升高（P<0.05）；而乳酸桿菌屬、不可培養(yǎng)的和巨型球菌屬、短狀桿菌屬、考克氏菌屬、棒狀桿菌屬、微球菌屬、羅思氏菌屬和鳥(niǎo)氨酸微球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、副球菌屬、金黃桿菌屬、異常球菌屬顯著降低（P<0.05）。

圖7 前處理后蛋源表面基于屬水平的微生物分析Fig.7 Microbial analysis based on genus level of egg source surface after pretreatment

前處理后蛋源表面主要產(chǎn)生豐度變化的菌屬如圖8所示。經(jīng)過(guò)二氧化氯協(xié)同加熱前處理后，蛋源表面的埃希氏菌屬、葡萄球菌屬、羅思氏菌屬和巨型球菌屬的豐度顯著降低，其中，埃希氏菌屬和葡萄球菌屬的豐度降為0，說(shuō)明前處理對(duì)蛋源表面的埃希氏菌屬和葡萄球菌屬的殺菌率達(dá)到100%，埃希氏菌屬和葡萄球菌屬的代表性致病菌有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，前處理方法可以最大程度降低液蛋制品生產(chǎn)中這兩類(lèi)致病菌污染；而不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬和梭菌屬的豐度升高，其中芽孢桿菌屬豐度從0.20%上升到64.49%，梭菌屬的豐度由0.18%上升到20.08%；蛋源進(jìn)行前處理后，99.9%的微生物被殺滅，菌屬豐度也隨之降低，而僅剩0.1%的微生物中，多數(shù)屬于芽孢桿菌屬、梭菌屬和不動(dòng)桿菌屬。這3 類(lèi)菌屬中包含蠟狀芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、溶血不動(dòng)菌屬等有害菌。雖然是少量存活，但還值得在接下來(lái)的液蛋制品處理中作為重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。

圖8 前處理后蛋源表面菌屬豐度的變化Fig.8 Changes in abundance of bacteria on the surface of egg source after pretreatment

對(duì)前處理后蛋源表面微生物多樣性聚類(lèi)熱圖分析，圖9 為前處理前后蛋源表面豐度前50 位的菌屬聚類(lèi)熱圖，紅色代表相應(yīng)樣品中豐度較高的屬，綠色代表豐度較低的屬。在未經(jīng)前處理的蛋源表面有38 個(gè)豐度較高和12 個(gè)豐度較低的屬；經(jīng)過(guò)前處理后，原有的38 個(gè)豐度較高的菌屬的豐度均降低，而原來(lái)豐度較低的梭菌屬、不動(dòng)桿菌屬和芽孢桿菌屬豐度升高，表明消毒前處理降低了蛋源表面微生物豐度，僅殘留少量菌屬。

圖9 前處理后蛋源表面微生物多樣性聚類(lèi)分析熱圖Fig.9 Microbial diversity clustering analysis heatmap of egg source surface after pretreatment

2.3 二氧化氯協(xié)同加熱前處理對(duì)蛋源表面常見(jiàn)致病菌的影響

將前處理后蛋源表面微生物多樣性進(jìn)行分析，用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)蛋源表面的大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌3 種常見(jiàn)致病菌進(jìn)行培養(yǎng)，從數(shù)量上對(duì)前處理方法進(jìn)行更直觀(guān)地觀(guān)察。由圖10可知，前處理后的蛋源表面菌落總數(shù)、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌數(shù)量顯著減少，其中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌未檢出，前處理對(duì)其殺菌率達(dá)到了100%，這與圖8 中大腸桿菌屬和葡萄球菌屬豐度變化結(jié)果一致。而沙門(mén)氏菌數(shù)量在前處理后雖與對(duì)照組未見(jiàn)顯著差異，但殺菌率也達(dá)到100%。無(wú)顯著差異是因?yàn)閷?duì)照組沙門(mén)氏菌中僅有一個(gè)平行樣品中檢測(cè)出1 CFU/個(gè)。因此可以說(shuō)明二氧化氯結(jié)合加熱前處理方法可有效殺滅蛋源表面常見(jiàn)的致病菌。

圖10 二氧化氯協(xié)同加熱前處理后蛋源表面常見(jiàn)致病菌的變化Fig.10 Changes in common pathogens on the surface of egg source after chlorine dioxide combined with heat treatment

3 討論

液蛋制品在蛋品生產(chǎn)工業(yè)中逐漸占據(jù)了重要地位，其易儲(chǔ)存運(yùn)輸，方便中小型蛋奶產(chǎn)品加工企業(yè)對(duì)液蛋制品的使用，免去其在打蛋過(guò)程中造成的微生物及蛋殼等污染，降低企業(yè)生產(chǎn)成本。但在工業(yè)生產(chǎn)液蛋制品時(shí)，不可避免的會(huì)有微生物污染，影響品質(zhì)和保質(zhì)期，因此控制液蛋制品生產(chǎn)過(guò)程的微生物污染至關(guān)重要。在眾多污染源中，蛋源微生物是液蛋制品的最主要污染源，蛋源的安全性是后續(xù)加工的保障和先決條件，因此有效的蛋源消毒方法是保證液蛋制品重要的工序之一[18-19]。紫外輻射（UV）消毒能顯著減少接種在殼蛋上的需氧細(xì)菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌數(shù)量[20-22]。將鮮蛋置于UV 下進(jìn)行殺菌照射，可殺滅蛋殼表面上97%的致病菌，從而達(dá)到消毒的目的[23-24]。紫外殺菌在工業(yè)上有所應(yīng)用，但存在殺菌效果不佳的問(wèn)題。熱風(fēng)巴氏殺菌法是近年來(lái)逐漸被關(guān)注的雞蛋表面清潔方法，目前通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)對(duì)雞蛋進(jìn)行消毒處理的研究還很少。因?yàn)闊犸L(fēng)殺菌時(shí)，如果溫度低需要時(shí)間較長(zhǎng)（55 ℃，180 min）[25]，如果縮短時(shí)間，則需要很高溫度（180 ℃，8 s），工業(yè)生產(chǎn)成本過(guò)高，不適宜生產(chǎn)。而今，巴氏消毒法已發(fā)展成蛋品領(lǐng)域成熟的商業(yè)滅菌系統(tǒng)。我國(guó)對(duì)禽蛋進(jìn)行巴氏消毒所用的水溫為64.5 ℃，處理時(shí)間為3 min；美國(guó)為60 ℃水溫條件下處理3 min；英國(guó)為64.5 ℃水溫條件下處理2.5 min[26]。然而，由于該過(guò)程的處理時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致蛋液中的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，影響雞蛋品質(zhì)。而巴氏殺菌溫度控制在55～60 ℃時(shí)，雖然可以降低蛋殼表面微生物數(shù)量，但由于處理時(shí)間較長(zhǎng)，很難用于工業(yè)生產(chǎn)。而使用消毒劑包括次氯酸鈉、二氧化氯、氫氧化鈉、碳酸鈉消毒，通常處理時(shí)間長(zhǎng)達(dá)15 min 以上[27]，工業(yè)生產(chǎn)受到極大限制；雖然高錳酸鉀、甲醛、過(guò)氧乙酸熏蒸、高錳酸鉀、過(guò)氧乙酸消毒效果較好，但是存在著安全性問(wèn)題。本研究通過(guò)比較不同物理、化學(xué)和物理化學(xué)協(xié)同消毒方法對(duì)蛋源表面微生物的作用效果，采用宏基因組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析了優(yōu)化后的消毒方法處理前、后蛋殼表面菌群多樣性，最終選擇二氧化氯作為協(xié)同法中的化學(xué)消毒劑，主要原因在于二氧化氯能有效殺死病毒、細(xì)菌、原生生物、藻類(lèi)、真菌和各種孢子[28]；而且具有不與有機(jī)物發(fā)生氯代反應(yīng)，不產(chǎn)生“致癌、致畸、致突變”物質(zhì)和其它有毒物質(zhì)，且安全無(wú)殘留；對(duì)人體無(wú)刺激[29-30]。但單純的二氧化氯消毒劑想要快速達(dá)到對(duì)蛋源的高效消毒并沒(méi)有得到實(shí)現(xiàn)，而在投入工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，延長(zhǎng)時(shí)間意味著大量成本的累加，因此，為了大大縮短處理時(shí)間，同時(shí)保證殺菌效果，選擇在化學(xué)處理后協(xié)同加熱處理，這樣不僅可以縮短前處理的時(shí)間，而且也可處理掉蛋源表面二氧化氯溶液的殘留。二氧化氯協(xié)同加熱法能將浸泡時(shí)間縮短到5 min，且將殺菌率提升到99.9%，對(duì)于常見(jiàn)的食品微生物致病菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的殺菌率更是達(dá)到100%，但僅存的0.01%微生物中多為芽孢桿菌屬、梭菌屬和不動(dòng)桿菌屬，這些菌屬需要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的化學(xué)劑消毒才可以達(dá)到滅菌效果，本研究的消毒前處理方法處理時(shí)間較短，暫時(shí)達(dá)不到對(duì)其完全滅菌的效果，因此如何能對(duì)殘留的微生物進(jìn)行徹底滅菌且滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)是接下來(lái)要研究的方向。經(jīng)過(guò)后續(xù)試驗(yàn)證實(shí)，二氧化氯協(xié)同加熱法未改變蛋液原有的功能性質(zhì)，卻在儲(chǔ)存過(guò)程中顯著降低了微生物的生長(zhǎng)繁殖[31]，達(dá)到延長(zhǎng)儲(chǔ)存期的目的。本研究對(duì)蛋液的前處理方法適于工業(yè)生產(chǎn)，可以配合工廠(chǎng)現(xiàn)有的清洗設(shè)備，達(dá)到降低成本的作用，具有很大的工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。

宏基因組學(xué)技術(shù)一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)定，可以高效準(zhǔn)確地測(cè)定出蛋源表面所有已知微生物菌群分布，在分析微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠通過(guò)從環(huán)境樣本中直接獲取的總DNA 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序[32]，用16SrRNA 基因測(cè)序數(shù)據(jù)估計(jì)微生物群落的物種構(gòu)成，更加真實(shí)地揭示原位環(huán)境中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性[33-34]。但在其高效精準(zhǔn)的同時(shí)，只能對(duì)菌群進(jìn)行定性分析，并不能直觀(guān)地得知每種微生物的數(shù)量；而傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)只能對(duì)已知微生物進(jìn)行單一的培養(yǎng)，而且很多微生物的培養(yǎng)檢測(cè)方法復(fù)雜繁瑣且靈敏度不高，還有很多微生物不能通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)，有很大的局限性，但傳統(tǒng)培養(yǎng)法可以對(duì)微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。本研究將宏基因組學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相結(jié)合，既能詳細(xì)的得知蛋源表面已知微生物菌群的多樣性變化，也能直觀(guān)得到食品主要致病菌的數(shù)量變化，兩種技術(shù)相結(jié)合，能更加有效地確定蛋源前處理方法的效果。

4 結(jié)論

最佳蛋源前處理方法為采用質(zhì)量濃度為125 mg/L 的二氧化氯浸泡5 min 后，用65 ℃熱水沖洗120 s，蛋殼表面微生物殺菌率達(dá)99.9%，菌群豐度及多樣性均顯著降低，僅剩不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬、梭菌屬以及少量其它菌屬；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見(jiàn)致病菌豐度均降低為0，與二氧化氯浸泡15 min 處理的殺菌效果一致，但有效減少了處理時(shí)間，提高了液蛋制品的生產(chǎn)效率。