任順成，萬 毅，李林政，潘天義

（1 河南工業(yè)大學(xué) 河南省天然色素制備重點實驗室 鄭州450001 2 河南中大恒源生物科技股份有限公司 河南漯河462600）

糖尿病是一種多病因綜合作用導(dǎo)致的代謝性疾病，其特點是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌不足和（或）作用障礙引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂。世界衛(wèi)生組織將糖尿病主要分為兩類：Ⅰ型糖尿病，主要原因是胰腺β-細胞遭到破壞，導(dǎo)致血漿胰島素水平低下；Ⅱ型糖尿病，是一種非感染性慢性代謝綜合征，其特點是胰島素分泌受損和靶組織對胰島素作用的抵抗而導(dǎo)致的高血糖[1]。據(jù)統(tǒng)計，Ⅱ型糖尿病是世界范圍內(nèi)最常見的糖尿病，占所有糖尿病患者的90%以上，被認為是主要的公共衛(wèi)生問題[2]。預(yù)計2030年糖尿病將成為人類第七大致死因素，被公認為 “無聲殺手”。預(yù)計到2035年，受影響的人數(shù)將增加到5.92 億[3]。世界衛(wèi)生組織最近公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界大約有15 億成年人超重和肥胖，這使他們具有患糖尿病的潛在風(fēng)險[4]。

在食物消化過程中，淀粉被α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶共同作用水解成單糖，抑制這些酶的活性可顯著降低餐后血糖升高[5-6]。抑制淀粉水解和葡萄糖的吸收是預(yù)防Ⅱ型糖尿病的有效途徑。近些年來，膳食活性成分在預(yù)防慢性疾病中的作用受到廣泛關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計，目前有800 余種植物提取物可能對糖尿病的治療起積極的作用[7]。關(guān)于植物提取物作為淀粉消化酶抑制劑的研究成為熱點。梔子是我國治療糖尿病傳統(tǒng)藥物，是一種含有多種有效活性成分的藥食兩用資源，具有抗炎、抗氧化、保護神經(jīng)等多種藥理作用[8-10]。肖小華等[11-12]報道梔子黃含量為1.67 g/kg 時能顯著降低不同糖負荷的小鼠血糖，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)梔子提取物對α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用的有效部分可能是環(huán)烯醚萜和梔子黃色素類。Zhou 等[13]通過研究梔子對治療Ⅱ型糖尿病的動物實驗糞便組學(xué)從側(cè)面證實了梔子黃的降糖效果。李春英等[14]報道梔子黃抑制α-葡萄糖苷酶活性，然而，具體作用機制不詳。本研究探討梔子黃對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的影響及其作用動力學(xué)，通過光譜特征分析兩種淀粉消化酶結(jié)構(gòu)變化，揭示梔子黃對餐后血糖升高的抑制作用機制，以期為糖尿病患者功能產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子黃（色價500），河南中大恒源生物科技有限公司；小麥淀粉（含水量12.89%），泰州市好食惠調(diào)味品有限公司；α-淀粉酶（50 U/mg），美國Sigma 公司；α-葡萄糖苷酶（7 000 000 U/mL），上海源葉生物科技有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（PNPG），麥克林生化科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。其余試劑均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600B 紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；FA1004 電子分析天平，上海上平儀器公司；Multiskan FC 96 孔酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司；G9800A 熒光分光光度計，安捷倫科技有限公司；MVS-1 旋渦混合器，北京金北德工貿(mào)有限公司；SHZ-82 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇華峰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梔子黃對α-淀粉酶抑制動力學(xué)研究 使用米氏方程（Michaelis-Menton）和Lineweaver-Burk 方程確定梔子黃對α-淀粉酶的抑制方式[15]。以小麥淀粉溶液作底物磷酸鹽緩沖液溶解后在80 ℃的水浴鍋中糊化30 min。淀粉質(zhì)量分數(shù)為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%。梔子黃溶液質(zhì)量濃度定為0.5，0.7 mg/mL。向具塞試管中先加入不同濃度梔子黃溶液250 μL，再添加250 μL α-淀粉酶溶解液37 ℃振蕩10 min，再加入500 μL 不同濃度的底物溶液，每隔5 min 取出相對應(yīng)的試管并加入2.0 mL DNS 顯色劑沸水中加熱5 min 后冷卻至室溫，定容至25 mL，540 nm 處測量其吸光度。

1.3.2 梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)研究α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶的試驗方法大致相同。梔子黃溶液濃度仍然為0.5，0.7 mg/mL，試驗中需要將作為底物的PNPG 溶液的濃度范圍設(shè)定為0.5～5.0 mmol/L。向96 孔酶標(biāo)板中先加入80 μL 磷酸鹽緩沖溶液按設(shè)定加入20 μL 不同濃度的梔子黃溶液和60 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃氣浴振蕩10 min 后加入20 μL PNPG 底物溶液，每隔5 min 取出酶標(biāo)板并加入100 μL 的0.2 mol/L 的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，用96 孔酶標(biāo)儀在405 nm 處測定吸光度。具體的方程計算情況與上述的α-淀粉酶的過程相一致。

1.3.3 α-淀粉酶熒光光譜測定 探究不同濃度梔子黃對α-淀粉酶的熒光猝滅光譜。在磷酸鹽緩沖液中配置質(zhì)量濃度0.025，0.1，0.3，0.5，0.7，1 mg/mL 的梔子黃；將α-淀粉酶（300 U/mL）溶解到pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液中，在3 mL 的α-淀粉酶的溶液中加入0.2 mL 不同濃度的梔子黃漩渦振蕩2 min 定容至10 mL。將混合液分別在30 ℃和37 ℃的水浴條件下恒溫振蕩30 min。以等量的梔子黃溶液為空白參比，激發(fā)波長278 nm，發(fā)射波長290 nm，狹縫寬度5 nm，在290～500 nm 波長范圍內(nèi)進行熒光發(fā)射光譜掃描。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶熒光光譜分析 α-葡萄糖苷酶熒光光譜分析與α-淀粉酶類似，其中α-葡萄糖苷酶的酶活力大小為180 U/mL 激發(fā)波長278 nm，發(fā)射波長290 nm，狹縫寬度5 nm，在290～450 nm 波長范圍下進行熒光發(fā)射光譜掃描。其中的對照試驗與上述α-淀粉酶的方法與操作相同。

同步熒光光譜試驗與1.3.3 節(jié)過程大致相同，在上述熒光猝滅試驗基礎(chǔ)上，將參數(shù)改變?yōu)椋害?淀粉酶，α-葡萄糖苷酶均在波長200～400 nm 范圍內(nèi)，通過設(shè)定激發(fā)波長間隔和發(fā)射波長間隔在△λ=15～60 nm 的設(shè)定下進行熒光光譜掃描[16]。

酶的抑制動力學(xué)可以通過以下方程表示：

Michaelis-Menton 方程：

Lineweaver-Burk 方程：

不同I下的雙倒數(shù)直線得出斜率Slope。利用I和Slope 再次作圖得出Kic。方程如下：

將斜率（Slope）或截距（Y-intercept）與I的二次重繪圖并進行線性擬合。式（1）、（2）、（3）、（4）中：V——初始反應(yīng)速度，mg/mL/min；S——底物質(zhì)量濃度，mg/mL；Vmax——最大初始反應(yīng)速度，mg/mL/min；I——抑制劑質(zhì)量濃度，mg/mL；α——表觀系數(shù)；Km——米氏常數(shù)；Kic——競爭性抑制常數(shù)；Kiu——非競爭性抑制常數(shù)。

熒光猝滅通過Stern-Volmer 方程描述：

式（5）中：F0和F——分別為不存在和存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強度；Ksv和Kq——分別為Stern-Volmer 猝滅常數(shù)和受擴散過程控制的雙分子熒光猝滅速率常數(shù)；[Q]——猝滅劑質(zhì)量濃度，mg/mL；τ0——熒光分子平均壽命（α-淀粉酶的τ0為2.97 ns，α-葡萄糖苷酶的τ0為10-8s）。

1.3.5 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)的計算 結(jié)合常數(shù)結(jié)合位點通過以下方程[17]描述：

式（6）中：Ka——梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)；n——結(jié)合位點數(shù)。

1.3.6 熱力學(xué)參數(shù)評價 小分子與生物大分子之間可通過疏水鍵、靜電引力、范德華力和氫鍵等發(fā)生相互作用。熱力學(xué)參數(shù)焓變ΔH和熵變ΔS可根據(jù)Van’t Hoff[15]方程確定：

式（7）中：R——大氣常數(shù)，其值為8.314 J/（mol·K）；T——反應(yīng)溫度（303 和310 K）；Ka——結(jié)合常數(shù)。自由能ΔG由下式計算：

ΔH和ΔS的值由lnKa對1/T的線性圖的斜率和截距計算。

1.3.7 梔子黃與淀粉消化酶相互作用的結(jié)合距離以水為參比，在300～500 nm 波長范圍內(nèi)掃描梔子黃的紫外光譜，并根據(jù)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光光譜和梔子黃的紫外吸收光譜的重疊圖譜計算結(jié)合距離。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種距離依賴的相互作用，它是由供體分子（蛋白質(zhì)）向受體分子（藥物）非輻射傳遞的激發(fā)能。能量傳遞效率可以用來評價配體與蛋白質(zhì)中色氨酸殘基之間的距離[18]。

非輻射能量轉(zhuǎn)移將發(fā)生在供體（α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶）和受體梔子黃之間，而條件是（a）供體可產(chǎn)生熒光；（b）供體的熒光發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有部分重疊；（c）供體和受體之間的距離約小于8 nm。根據(jù)F?rster 非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[19]，能量轉(zhuǎn)移效率（E）不僅與受體和供體之間的距離（r）有關(guān)，而且與臨界能量轉(zhuǎn)移距離（R0）有關(guān)，即：

式（9）中：R0——轉(zhuǎn)移效率為50%時的臨界距離，nm；r——受體與供體之間的距離，nm。

式（10）中：K2——供體與受體各項隨機分布的空間取向因子；N——介質(zhì)的折射率；φ——不存在受體的情況下供體熒光量子產(chǎn)率；J——供體熒光發(fā)射光譜和受體吸收光譜之間的重疊積分；其計算公式如下：

式（11）中：F（λ）——熒光供體在波長λ 的熒光強度；ε（λ）——受體在波長λ 下的摩爾吸光系數(shù)。能量轉(zhuǎn)移效率E計算公式為：

式中：F0和F與方程式（5）中的相同。

1.3.8 統(tǒng)計分析 使用origin2017 作圖，使用SPSS 21 統(tǒng)計軟件包分析所有數(shù)據(jù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）。P<0.05 被認為是顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制動力學(xué)研究

本研究用淀粉和pNPG 作為底物得到α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的Lineweaver-Burk 圖，并確定其抑制類型，結(jié)果見圖1 和表1。對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶來說最大速度（Vmax）值為0.52 和3.11×10-2mg/（mL·min）保持不變，不同濃度的梔子黃存在均使米氏常數(shù)（Km）增加表明：梔子黃在兩種酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）分子上與酶-底物結(jié)合位點競爭結(jié)合并形成復(fù)合物，繼而通過減少底物與酶的結(jié)合來降低酶促速率。即梔子黃與α-淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶的活性中心結(jié)合，從而產(chǎn)生對酶蛋白活性的影響。這與多酚類物質(zhì)抑制淀粉消化酶類似[20]。競爭性抑制常數(shù)Kic是抑制劑-酶復(fù)合物的解離常數(shù)，因此，1/Kic代表抑制劑與酶的締合常數(shù)；Kic值較低意味著抑制劑與酶活性位點的結(jié)合親和力較高[21]。梔子黃對α-淀粉酶的Kic（1.47）大于α-葡萄糖苷酶Kic（0.58），意味著梔子黃對α-葡萄糖苷酶的結(jié)合親和力更高。

圖1 梔子黃對α-淀粉酶（a）和α-葡萄糖苷酶（b）抑制作用的Lineweaver-Burk 曲線Fig.1 Lineweaver-Burk curve of inhibitory effect of gardenia yellow on α-amylase（a）and α-glucosidase（b）

表1 梔子黃對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)參數(shù)Table 1 Inhibitory kinetic parameters of gardenia yellow on α-amylase and α-glucosidase

2.2 熒光光譜分析

圖2、圖3 反映了不同濃度的梔子黃在不同溫度下對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶之間的熒光光譜圖。隨著梔子黃濃度的增大，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的熒光強度呈現(xiàn)不同程度的降低，即熒光猝滅現(xiàn)象。此外，圖2 和圖3 發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射峰所處的波長發(fā)生紅移，說明梔子黃與兩種淀粉消化酶發(fā)生相互作用。為了闡述作用機制，使用Stern-Volmer 方程分析熒光數(shù)據(jù)。

圖2 梔子黃對α-淀粉酶熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectrum of gardenia yellow to α-amylase

圖3 梔子黃對α-葡萄糖苷酶熒光光譜圖Fig.3 The fluorescence spectrum of gardenia yellow to α-glucosidase

圖4 的Stern-Volmer 圖可以看到梔子黃對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer 的曲線是向y軸彎曲的曲線。熒光測量提供了有關(guān)發(fā)色團分子附近分子環(huán)境的信息。蛋白質(zhì)熒光強度的降低稱為蛋白質(zhì)熒光猝滅，這種猝滅可通過不同的機制，碰撞猝滅（動態(tài)猝滅）是激發(fā)態(tài)熒光團與溶液中的其它分子（猝滅劑）接觸而失活時發(fā)生。靜態(tài)猝滅為熒光團與猝滅劑形成非熒光配合物[22]。線性Stern-Volmer 曲線表明蛋白質(zhì)中有一類熒光團以相同的方式與淬滅劑相互作用，并且只有一種淬滅機制（動態(tài)或靜態(tài)）發(fā)生。然而，當(dāng)淬滅程度較大時，經(jīng)常觀察到方程的正偏差。在這種情況下，F(xiàn)0/F與[Q]描述了一條向上的曲線，向y軸凹陷。通常，向上彎曲表明有幾種機制負責(zé)蛋白質(zhì)中熒光團的猝滅效應(yīng)（既有動態(tài)猝滅又有靜態(tài)猝滅），或者它表明存在“作用域”（作用范圍[22]），即表觀靜態(tài)猝滅[23]。描述這種情況的Stern-Volmer方程的修改形式如下[20]：

圖4 梔子黃對α-淀粉酶（a）和α-葡萄糖苷酶（b）熒光淬滅Stern-Volmer 圖的影響Fig.4 Influences of gardenia yellow on fluorescence quenching Stern-Volmer graphs of α-amylase（a）and α-glucosidase（b）

將此方程兩邊取自然對數(shù)，作ln（F0/F）與[Q]的圖，得到一條直線，該直線斜率即為表觀靜態(tài)常數(shù)KSV即：

生物高聚物在不同的猝滅劑最大動態(tài)猝滅常數(shù)是2×1010mol-1s-1，表2 中梔子黃對α-淀粉酶的猝滅常數(shù)（1.40×1011mol-1s-1/1.26×1011mol-1s-1）和α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅常數(shù)（2.92×1011mol-1s-1/5.10×1011mol-1s-1）遠大于2×1010mol-1s-1，說明了猝滅方式是靜態(tài)猝滅為主，此外，猝滅常數(shù)反映了猝滅劑與生物高聚物的親和性[16，24]，α-葡萄糖苷酶的猝滅常數(shù)大于α-淀粉酶，說明梔子黃對α-葡萄糖苷酶有更好的親和力。也印證了2.1 節(jié)抑制動力學(xué)上梔子黃對α-葡萄糖苷酶有著更好的抑制作用。

圖5 梔子黃對α-淀粉酶（a）和α-葡萄糖苷酶（b）熒光淬滅Stern-Volmer 圖修改圖的影響Fig.5 Influences of gardenia yellow on modified fluorescence quenching Stern-Volmer charts of α-amylase（a）and α-glucosidase（b）

表2 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的Stern-volmer 方程及參數(shù)Table 2 Stern-Volmer equation and parameters of α-amylase and α-glucosidase

2.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合點數(shù)

梔子黃對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合點數(shù)n如表3所示，隨著溫度的變化，兩種淀粉消化酶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合點數(shù)都發(fā)生了一定的變化，側(cè)面反映了溫度是梔子黃對兩種酶作用的重要因素，隨著溫度的升高，α-淀粉酶的Ka值下降，表明了梔子黃對α-淀粉酶的作用隨著溫度的升高，其親和力下降。而α-葡萄糖苷酶隨著溫度的升高其與梔子黃的親和力逐漸上升（30～37 ℃之間）。n值略大于1 說明了梔子黃對于兩種消化酶的作用可能有著超過一個或者一類的結(jié)合位點[16]。也從數(shù)據(jù)可以看出在37 ℃的條件下α-葡萄糖苷酶的Ka大于α-淀粉酶，表明α-葡萄糖苷酶與梔子黃的親和力在同等條件下大于α-淀粉酶，與之前抑制動力學(xué)結(jié)果類似。

表3 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶結(jié)合常數(shù)及結(jié)合點數(shù)Table 3 Binding constants and binding points of α-amylase and α-glucosidase

2.4 熱力學(xué)參數(shù)計算

熱力學(xué)分析為了確定在上述基礎(chǔ)上梔子黃與淀粉消化酶相互作用的主因。表4 計算了α-淀粉酶的ΔH和ΔS的值為分別-43.22，-34.01 kJ/mol；α-葡萄糖苷酶ΔH和ΔS分別為234.882，0.874 kJ/mol。可以根據(jù)表5 中ΔH、ΔS取值情況推導(dǎo)出配體和生物分子之間作用力類型[25]。結(jié)果表明，梔子黃與淀粉消化酶（α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的ΔG均為負值，表明結(jié)合過程是自發(fā)發(fā)生的。如表5所示，范德華力是梔子黃-α-淀粉酶相互作用過程中的主要驅(qū)動力。疏水作用力是梔子黃-α-葡萄糖苷酶相互作用過程中的主要驅(qū)動力[26]。

表4 α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶熱力學(xué)參數(shù)計算Table 4 Calculation of thermodynamic parameters of α-amylase and α-glucosidase

表5 熱力學(xué)參數(shù)分析Table 5 Thermodynamic parameter analysis

2.5 同步熒光測量

由圖可知，隨著梔子黃的加入α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的兩種氨基酸殘基發(fā)生熒光猝滅，當(dāng)Δλ=15 nm 時，α-淀粉酶的酪氨酸殘基最大發(fā)射波長從297 nm 藍移至284 nm。α-葡萄糖苷酶的酪氨酸殘基最大發(fā)射波長從292 nm 藍移至287 nm。藍移和紅移分別代表熒光載體（Tyr 和Trp）周圍疏水性和極性環(huán)境的增強[25]。可能由于梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用，引發(fā)酶的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致兩種淀粉消化酶酪氨酸殘基疏水性增加，所處微環(huán)境的極性有所減弱。當(dāng)Δλ=60 nm 時，可明顯看出α-淀粉酶的色氨酸殘基最大發(fā)射波長從287 nm 紅移至290 nm，而α-葡萄糖苷酶的色氨酸殘基變化不大，該結(jié)果闡明了α-淀粉酶因梔子黃的加入使色氨酸殘基所處微環(huán)境的極性，也一定程度反映了隨著在梔子黃加入對α-淀粉酶酪氨酸殘基和色氨酸殘基附近都會產(chǎn)生構(gòu)象的變化，而梔子黃對α-葡萄糖苷酶的影響主要是在酪氨酸殘基附近。

圖6 α-淀粉酶同步熒光光譜圖Fig.6 Synchronous fluorescence of α-amylase

圖7 α-葡萄糖糖苷酶同步熒光光譜Fig.7 The synchronous fluorescence spectrum of α-glucosidase

2.6 梔子黃與淀粉消化酶結(jié)合距離計算

梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合距離見表6。從表6 可以看出梔子黃與α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合距離r分別為4.77 nm 和5.19 nm，均小于8 nm，且都滿足0.5R0＜r＜1.5R0的條件，表示梔子黃與兩種淀粉消化酶之間可以發(fā)生相互作用且極可能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移[27-29]。

圖8 梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶重疊光譜圖Fig.8 Overlapping spectra of gardenia yellow with α-amylase and α-glucosidase

表6 梔子黃與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的結(jié)合距離Table 6 Binding distance between gardenia yellow and α-amylase and α-glucosidase

3 結(jié)論

梔子黃通過競爭性抑制的方式能顯著抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的活性。相比于α-淀粉酶，梔子黃對α-葡萄糖苷酶的親和力可能更高。梔子黃通過自發(fā)的范德華力、疏水作用力分別對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶發(fā)生相互作用。梔子黃能夠引起兩種酶氨基酸殘基的構(gòu)象改變，主要作用兩種酶的酪氨酸殘基和色氨酸殘基。非輻射能量轉(zhuǎn)移在梔子黃與兩種消化酶之間發(fā)生概率很大，進一步印證了梔子黃與兩種消化酶相互作用的可能性。該研究表明梔子黃可能對糖尿病患者癥狀改善具有積極的作用，這為篩選淀粉消化酶抑制劑及相關(guān)功能食品的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。