陳利民， 吳倩倩， 何天駿， 潘逸明， 陳婷婷， 吳全聰*

(1.麗水市農(nóng)林科學研究院，浙江 麗水 323000； 2.福建農(nóng)林大學 閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室，福建 福州 350002；3.浙江農(nóng)林大學 農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江 杭州 311300； 4.麗水學院 生態(tài)學院，浙江 麗水 323000)

菜豆(PhaseolusvulgarisL.)作為我國食用豆科作物種植面積排名前三的作物，廣泛種植于全國各種植區(qū)。自古以來，菜豆在我國傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)和可持續(xù)農(nóng)業(yè)的種植體系中均發(fā)揮著重要的作用[1]。但是隨著規(guī)模化種植年限的增加，種植面積的不斷擴大，以及近年來新品種育種過分追求產(chǎn)量目標而忽略了對抗病蟲種質(zhì)資源的利用和保護，致使由腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxyporum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、鏈格孢(AlternariaNees)、疫霉(Phytophthora)、齊整小菌核(Sclerotiumrolfsii)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)等病原菌單獨或復合侵染引起的根腐病發(fā)生呈逐年加重趨勢[2]，已嚴重影響到世界各菜豆種植區(qū)的菜豆產(chǎn)量。據(jù)報道，我國部分菜豆種植區(qū)由根腐病引起的菜豆損失高達84%，部分非洲種植區(qū)高達100%[3]。

菜豆根腐病初發(fā)病時主根上出現(xiàn)紅色至棕色條紋，逐漸形成損傷和壞死。隨著菜豆植株的生長，開花結(jié)莢后癥狀逐漸明顯，根腐病呈逐漸加重趨勢，表現(xiàn)為菜豆植株自基部葉片開始枯萎發(fā)黃，最終導致根部完全腐爛。當前實際生產(chǎn)過程中多以化學藥劑防控為主，但是由于鐮刀菌針對性藥劑偏少，且菜豆根腐病多為多種病原菌復合侵染所致[4]，致使傳統(tǒng)化學防控效果普遍偏差。不僅如此，在菜豆根腐病的防控過程中，多以化學藥劑直接灌根為主，大量化學藥劑直接施用于土壤中，極易對生態(tài)環(huán)境造成不可逆的嚴重污染，甚至危及人類健康和生命安全。作為一種新型的植物病蟲害防控策略，植物免疫激活調(diào)節(jié)劑的應用受到越來越多的關(guān)注，其中尤以6%寡糖·鏈蛋白應用最為廣泛，并且在小麥、水稻、煙草、西瓜、葡萄等作物上均有較好的應用與推廣[5-10]，在菜豆及根腐病防控方面鮮有報道?；诖耍狙芯糠謩e用6%寡糖·鏈蛋白20、80、200、500、1 000倍液浸泡種子，對菜豆根腐病防控效果及抗性相關(guān)酶活力的影響進行了系統(tǒng)比較，以期為科學、綠色防控菜豆根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及處理

6%寡糖·鏈蛋白(阿泰靈)植物免疫激活劑由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所廊坊農(nóng)藥中試廠提供。試驗所用試劑均為分析純級，所用水為超純水(ddH2O)，化學品從上海生工生物科技有限公司(上海，中國)或Sigma Chemical Do.(St. Louis，MO，USA)購買。所用菜豆品種為麗蕓2號，盆栽所需土壤取自菜豆連作5 a以上且根腐病發(fā)生嚴重田塊，土壤陰至微干后過5目篩備用。

本試驗培養(yǎng)條件同6%寡糖·鏈蛋白誘導菜豆抗根腐病效果比較步驟。試驗處理前種子均采用清水于28 ℃下浸種12 h，選取吸水充分，且無損傷的種子用于試驗。試驗設6個處理，T1為6%寡糖·鏈蛋白20倍液、T2為6%寡糖·鏈蛋白80倍液、T3為6%寡糖·鏈蛋白200倍液、T4為6%寡糖·鏈蛋白500倍液、T5為6%寡糖·鏈蛋白1 000倍液、CK為清水浸泡種子10 min。各處理浸泡完成后，于定性濾紙上晾干后用于播種，每組處理20盆盆栽菜豆，設置3個生物學重復。本試驗于晝/夜溫度為(25±1)℃/(18±1)℃，光周期L/D為16 h/8 h，相對濕度為60%±5%的環(huán)境下進行。播種后每天檢查種子萌發(fā)情況并記錄，并于出苗后14 d檢查各處理幼苗根腐病發(fā)病病情指數(shù)。

1.2 測定內(nèi)容及方法

播種間隔12 h記錄菜豆出苗情況，計算出苗率。在菜豆出苗后7 d，隨機挖取9株測量根系長度。采用SPAD-502 Plus葉綠素測定儀測葉綠素含量，每片葉片各測5個點，隨機調(diào)查9株。于播種后9 d采集菜豆根系、葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于測量根系活力及各類抗性相關(guān)酶活性。將完整的根洗凈，用濾紙蘸去其上的水分，采用TTC法測定其根系活力[5]。β-1,3-葡聚糖酶的測定方法參考余永廷[11]的方法，用葡萄糖為標準品制作標準曲線，得到標準曲線方程為Y=1.552x-0.047(R2=0.994)，根據(jù)曲線計算樣品產(chǎn)生的葡萄糖量。多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定參照棉花的測定方法[12]。幾丁質(zhì)酶活性檢測參照左豫虎[13]對大豆的測定方法。

菜豆根腐病分級標準參照蕓豆根腐病分級標準[3]。0級：植株莖基部和主根均健康無褐色病斑；1級：莖基部和主根上有少量褐色病斑；3級：莖基部或主根上褐色病斑較多，褐色病斑面積占莖和根總面積的25%～50%；5級：莖基部及主根上病斑多且較大，病斑面積占莖基部和根總面積的51%～75%；7級：莖基部或主根上病斑連片，形成繞莖現(xiàn)象，但根系并未死亡失活；9級：根系壞死，植株地上部萎蔫或死亡。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗所得數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 19.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)與Microsoft Excel 2010進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 對菜豆出苗率的影響

經(jīng)不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種后菜豆出苗率存在差異。出全苗前，隨著時間的延長，各處理出苗率均不同程度低于CK。播種后12 h各處理均無菜豆出苗；24 h CK出苗率達100%，且與T1和T2存在顯著性差異，其他各處理出苗率均達80%以上，且與T1存在顯著性差異；36 h T5出苗率亦達到100%，此時除T1外其他各處理出苗率均達90%以上，且T1出苗率顯著性低于其他各處理；48 h T4出苗率亦達到100%，T1出苗率為80.6%，為各處理出苗率最低，且顯著低于T2、T4、T5和CK(表1)。

表1 不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種后菜豆的出苗率

2.2 對菜豆生理指標的影響

葉綠素含量各處理間無明顯差異，以T1和T2含量相對較高。各處理間根系長度雖無顯著性差異，但以T5和T4根系相對較長，且各試驗處理根系均長于CK。各處理間根系活力差異相對較大，隨著稀釋倍數(shù)的增加，根系活力呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，其中T3根系活力顯著性低于T1、T5和CK，同時CK根系活力顯著性高于T4(圖1)。

柱上無相同字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。

2.3 對菜豆抗性相關(guān)酶活的影響

在出苗后7 d經(jīng)不同稀釋倍數(shù)6%寡糖·鏈蛋白浸種處理后播種的菜豆幼苗，在抗性相關(guān)酶活性方面存在較大差異。CK、T2和T3的菜豆葉片中，β-1,3-葡聚糖酶活性顯著高于T1和T5，在根部表現(xiàn)出相似的趨勢；隨著稀釋倍數(shù)的增加菜豆葉片和根部PPO酶活性呈下降趨勢，且各試驗處理均顯著性高于CK；隨著稀釋倍數(shù)的增加菜豆葉片POD酶活性呈下降趨勢，其中T1和T2顯著高于CK和T5，在根部該酶活性以T3和T4最高，且顯著高于其他各處理，同時T1和T2亦顯著高于CK；

PAL活性在各試驗處理間差異不顯著，僅在菜豆根部T3顯著高于CK，其他各試驗處理雖均高于CK，但差異不顯著；在菜豆葉片內(nèi)幾丁質(zhì)酶的活性以CK最高，T2和T5次之，T1、T3和T4活性相對較低，其中CK顯著高于T1、T3和T4，在菜豆根部該酶的活性以CK和T5最高，T3和T4次之，T1和T2最低，CK顯著高于除T5外的各試驗處理(表2)。

表2 不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種對菜豆抗性相關(guān)酶活的影響

2.4 對菜豆根腐病防控效果的影響

經(jīng)不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種處理后播種，出苗后15 d，各試驗處理組病情指數(shù)均顯著低于CK，同時亦表現(xiàn)出不同的防治效果。T1對菜豆根腐病的防治效果最佳，防治效果可達50%左右，T2次之，其他各試驗處理防治效果為30%左右，其中T1與除T2外的其他各處理均形成了顯著性差異，同時各試驗處理對菜豆根腐病的防效均顯著高于對照處理。

表3 不同濃度6%寡糖·鏈蛋白浸種對菜豆根腐病防控效果的影響

3 小結(jié)與討論

6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑—阿泰靈，自登記以來在水稻、西瓜、葡萄、茶葉等多種農(nóng)作物及水果上均有應用報道，在抗病抗蟲方面均有較好的應用效果，但其在菜豆上的應用，以及作為種子處理劑的應用鮮有報道。本研究以20、80、200、500、1 000倍的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑稀釋液浸泡菜豆種子，對出苗率、根系長度、葉綠素含量、根腐病防治效果、抗性相關(guān)酶活性等進行了分析比較，以期初步明確6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑作為種子處理劑在菜豆上的使用方法，及對根腐病的防控機理。

結(jié)果表明，各稀釋倍數(shù)的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子，對菜豆根腐病均有顯著性防治效果，其中稀釋20倍對菜豆根腐病防控效果最佳，且顯著性優(yōu)于其他各處理，其次為稀釋80倍和500倍，稀釋200倍和1 000倍效果相對一般，與CK相比防治效果均低于30%。但是，在對各稀釋倍數(shù)的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子的出苗率進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子對種子發(fā)芽有一定抑制作用，并且稀釋20、80和200倍能夠顯著性降低菜豆的出苗率，這與張強等[7]在水稻上的試驗結(jié)果有一定差異，可能與本試驗采用浸種的6%寡糖·鏈蛋白濃度過高有關(guān)。為了進一步研究各稀釋倍數(shù)的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子對菜豆幼苗可能造成的影響，本試驗同時對播種后9 d的菜豆幼苗葉綠素含量、根系活力等指標進行了統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，各稀釋倍數(shù)的6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子對菜豆幼苗無明顯抑制作用。

PPO和POD是植物體內(nèi)廣泛存在的抗性相關(guān)活性酶[14]，能增加植株幼嫩組織的木質(zhì)化程度及醌類化合物形成，構(gòu)成保護性屏障而使細胞免受病菌的侵害，也可以通過形成醌類物質(zhì)直接發(fā)揮抗病作用。亦可通過催化作用，將植物細胞內(nèi)多余的H2O2還原為H2O。作為苯丙烷類代謝中最為重要的代謝催化酶[15]，PAL可催化形成包括植保素、木質(zhì)素和酚類化合物等抗病次生物質(zhì)。β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶可以降解大多數(shù)真菌細胞壁[16-18]，阻止或中斷真菌在植物體內(nèi)的侵染、定殖和擴展，在抗真菌病害的研究方面亦受到廣泛關(guān)注。本研究表明，不同稀釋倍數(shù)的6%寡糖·鏈蛋白浸種，對菜豆苗期葉片和根部的PPO和POD均有一定的誘導上調(diào)作用，這與盛世英等[5]在小麥上的研究以及李培玲等[19]在馬鈴薯上的研究相一致，而在PAL、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶3個抗性相關(guān)酶活性方面無明顯變化規(guī)律，這說明6%寡糖·鏈蛋白可通過激發(fā)PPO和POD 2個關(guān)鍵抗性相關(guān)酶活性，從而產(chǎn)生防御反應，這是誘導菜豆抗根腐病的重要機制之一。

綜上研究結(jié)果表明，6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑浸泡菜豆種子，能夠激發(fā)菜豆幼苗的抗病性，減少病害發(fā)生，保障菜豆健康生長，是菜豆安全生產(chǎn)中的綠色防控方法。在稀釋倍數(shù)方面，以500倍稀釋液浸種效果最佳，濃度過高會抑制菜豆種子的萌發(fā)，降低出苗率。在抗病機制方面，6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑可顯著提高菜豆中具有廣譜抗病功能的PPO和POD等抗性相關(guān)酶活性，能夠激發(fā)菜豆廣譜抗病性，不僅對根腐病具有較高防治效果，同時對其他病害亦有一定防控作用。