李濟(jì)民，朱 輝，徐 可，王 飛，楊 璐，葉澤康，談楚楚，顧 倩，王 靜，李春堅(jiān)*

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟科，江蘇 南京 210029；2阜陽市第五人民醫(yī)院心血管內(nèi)科二病區(qū)，安徽 阜陽 236000；3南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院老年病科，江蘇 常州 213000

抗血小板治療是冠心?。╟oronary artery dis?ease，CAD）藥物治療的基石。作為二磷酸腺苷（ade?nosine diphosphate，ADP）受體拮抗劑，氯吡格雷被廣泛應(yīng)用于急性冠脈綜合征（acute coronary syn?drome，ACS）或冠狀動(dòng)脈支架植入后的CAD患者［1-2］。但研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷的抗血小板療效存在顯著的個(gè)體差異，20%以上的患者在服用常規(guī)劑量的氯吡格雷時(shí)血小板聚集功能未被有效抑制［3］，稱為氯吡格雷低反應(yīng)性（clopidogrel low response，CLR）或氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）［4］。研究顯示，CLR 患者的支架內(nèi)血栓、心肌梗死和全因死亡的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加［5］。

microRNA（miRNA）是一類長18～22 nt 的非編碼RNA，其可通過與靶信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。Nagalla等［6］發(fā)現(xiàn)健康志愿者中血小板高反應(yīng)組與正常反應(yīng)組間血小板miRNA 存在表達(dá)差異，miRNA可以通過與mRNA結(jié)合來調(diào)控血小板蛋白的表達(dá)，從而影響血小板活性。本研究旨在通過篩查CLR患者血小板miRNA表達(dá)的差異，探尋對血小板聚集關(guān)鍵蛋白（P2Y12受體、Gi2α蛋白、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體）可能有調(diào)控作用的miRNA，為個(gè)體化抗血小板治療提供新的靶標(biāo)。

1 對象和方法

1.1 對象

連續(xù)入選2015年4月—8月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科經(jīng)常規(guī)氯吡格雷治療（負(fù)荷劑量300 mg，維持劑量75 mg/d）至少5 d 的CAD 患者78 例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～80 歲；②入院診斷為急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）、不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UA）或穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SA）；③簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①氯吡格雷過敏或不耐受者；②高出血風(fēng)險(xiǎn)患者（如血小板計(jì)數(shù)<80×109/L、活動(dòng)性消化性潰瘍、近期腦外傷史等）；③計(jì)劃服用華法林或可能干擾氯吡格雷［如細(xì)胞色素P450 3A（cyto?chrome P450 3A，CYP3A）抑制劑或CYP3A 誘導(dǎo)劑等］抗血小板療效的藥物。本研究已在clinicaltrials.gov 網(wǎng)站注冊，ID號(hào)：NCT02447809。

光學(xué)血小板聚集儀（light transmittance ag?gregometry，LTA；540VS，Chronolog公司，美國），全自動(dòng)血液分析儀（XS?500i，Sysmex公司，日本），高速離心機(jī)（Centrifuge 5810 R）、移液槍（Eppendorf 公司，德國），反應(yīng)杯、攪拌磁棒（Chronolog 公司，美國），漩渦震蕩儀（上海青浦瀘西儀器廠），pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），去離子水制水設(shè)備（Mer?ck Millipore 公司，德國），電泳儀（Bio?Rad 公司，美國），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），Agi?lent 2200TapeStation（Agilent Technologies 公司，美國），Qubit 2.0（Life Technologies 公司，美國），Hiseq 2500（Illumina 公司，美國），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、分光光度計(jì)、水浴鍋（Thermo Fisher Scientific 公司，美國），磁珠分選磁鐵架（Miltenyi Biotec 公司，德國），電子天平（Mettler Toledo公司，瑞士），凈化工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），制冰機(jī)（SANYO公司，日本），Illumina Hiseq 2500測序儀（Illumina公司，美國）。

TRIzol（Invitrogen 公司，美國），mirVanaTMmiR?NA Isolation Kit（Life Technologies 公司，美國），CD45 MicroBeads，human（Miltenyi Biotec 公司，德國），Small RNA Sample Prep Kit（Illumina 公司，美國），終濃度為5 μmol/L 的ADP（Chronolog 公司，美國），氫氧化鈉、鹽酸、冰醋酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），乙二胺四乙酸、瓊脂糖、MOPS、PBS 粉劑（合肥Biosharp公司），枸櫞酸鈉（西隴化工股份有限公司），無水乙醇、甲醛（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），DEPC 水（Invitrogen 公司，美國），甲酰胺（上海麥克林生化科技有限公司），5 mL枸櫞酸鈉1∶9 抗凝的采血管（BD 公司，美國），CD45 抗體、LD 磁珠分選柱（Miltenyi Biotec 公司，德國），0.22 μm無菌濾器（Merck Millipore公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 血小板聚集率測定

在患者服用氯吡格雷后2.5 h，用含3.2%枸櫞酸鈉抗凝管采集肘靜脈血樣8 mL，并于標(biāo)本采集后2 h內(nèi)完成LTA 法血小板聚集功能檢測，具體方法如下：在常溫下將采集的血標(biāo)本以200g離心8 min，用移液槍緩慢抽取離心后血標(biāo)本的上清液以獲取富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）；用全自動(dòng)血液分析儀檢測PRP中的血小板計(jì)數(shù)；將吸取PRP后剩余的血樣常溫下以2 460g離心10 min，用移液槍緩慢抽取血標(biāo)本的上清液以獲取貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）；用PPP 作為稀釋液將PRP中的血小板濃度稀釋至250×109/L（如PRP中的血小板濃度在250×109/L以下，則無需稀釋）；向PRP中加入2.5 μL終濃度為5 μmol/L的ADP，測定8 min最大血小板聚集率。

參照CREST研究，將ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率（platelet aggregation induced by adenosine diphos?phate，PLADP）大于上四分位數(shù)定義為氯吡格雷低反應(yīng)性［7］，小于下四分位數(shù)者設(shè)為對照組。

1.2.2 血小板純化與RNA提取及變性電泳

在患者進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影時(shí)，經(jīng)鞘管采集15 mL動(dòng)脈血于枸櫞酸鈉抗凝管，以200g離心10 min，移取上層PRP，用免疫磁珠法分選白細(xì)胞與血小板比例低于1∶5 000 000 的純化血小板（具體操作參考CD45 MicroBeads LD 磁珠分選柱的說明書）。用TRIzol 裂解上述純化血小板，再用mirVanaTMmiR?NA Isolation Kit 提取裂解后血小板中的總RNA（具體操作參考TRIzol 及mirVanaTMmiRNA Isolation Kit說明書），最終將每份樣本的總RNA 溶解于20 μL無RNase 的的DEPC 水中置-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。通過Nanodrop 分光光度計(jì)檢測每個(gè)樣本總RNA 的濃度及260 nm/280 nm 的吸光度（OD）比值，確認(rèn)每個(gè)總RNA 樣本的OD 比值均在1.8～2.0 之間。按上述分組結(jié)果，將氯吡格雷低反應(yīng)組和對照組患者的總RNA 分別混為2 個(gè)RNA 池。分別從2 組RNA 池中取RNA樣本1.5 μg，按照相應(yīng)配比加入10×MOPS、甲醛、甲酰胺并混勻，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行變性電泳。

1.2.3 測序文庫的構(gòu)建及測序

每例樣本取1.5 μg 總RNA 行15%尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后對18～32 nt片段進(jìn)行切割、洗脫、純化回收。采用Small RNA Sample Prep Kit（Il?lumina，美國）構(gòu)建小RNA文庫。純化后的小RNA序列采用T4 RNA連接酶將接頭引物分別連接至2個(gè)文庫的序列5′端和3′端，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，PCR建立小RNA文庫。利用Illumina HiSeq 2500測序平臺(tái)對該文庫進(jìn)行高通量測序。

1.2.4 小RNA數(shù)據(jù)處理和信息分析

測序所得長度為51 nt 的小RNA 序列通過去接頭、去除低質(zhì)量和污染序列，最終獲得18～32 nt的高質(zhì)量小RNA 序列。統(tǒng)計(jì)小RNA 的種類、數(shù)量及長度分布，初步判斷小RNA質(zhì)量。采用mirdeep2軟件將所得小RNA序列與參考基因組進(jìn)行比對分析，再將匹配序列分別與GenBank 和Rfam 10.0 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，篩選出miRNA 序列并分類注釋，分析其表達(dá)情況。

1.2.5 miRNA差異表達(dá)分析

將樣本中的miRNA 表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為TPM（tags per million），應(yīng)用EdgeR 軟件對2 對樣本已知miR?NA表達(dá)差異分析統(tǒng)計(jì)。將“差異倍數(shù)”絕對值≥2且P<0.05的miRNA定義為差異表達(dá)的miRNA。差異倍數(shù)=Log2（氯吡格雷低反應(yīng)組miRNA 標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)量/對照組miRNA標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)量）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布者采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組計(jì)量資料的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)性分布者用中位數(shù)與四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s精確檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床基線資料及患者分組

根據(jù)入選患者的PLADP結(jié)果計(jì)算出四分位數(shù)P25=19.5%，P75=48.5%。選取PLADP＞48.5%的氯吡格雷低反應(yīng)性患者19例為低反應(yīng)組，為了更明顯地篩選出血小板miRNA 表達(dá)譜的差異，將PLADP<19.5%的19 例患者設(shè)為對照組。兩組患者的臨床基線特征包括年齡、性別、體重指數(shù)、臨床診斷、既往史及合并用藥等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。兩組患者住院期間的生化指標(biāo)包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿素氮、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、射血分?jǐn)?shù)等亦無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。

表1 患者臨床基線特征Table 1 Baseline clinical characteristics of the patients

表2 患者住院期間的生化指標(biāo)Table 2 Biochemical indexes of the patients during hospitalization

2.2 住院期間的血小板聚集率

氯吡格雷低反應(yīng)組和對照組的PLADP分別為54.8%±5.3%vs.13.3%±4.4%，組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.000 1，圖1）。

圖1 兩組患者血小板聚集率Figure 1 Platelet aggregation in the two groups

2.3 血小板總RNA的變性電泳

經(jīng)Nanodrop分光光度計(jì)檢測，氯吡格雷低反應(yīng)組的血小板總RNA 池OD值為2.0，濃度為30.3 ng/μL。對照組的血小板總RNA 池OD 比值為1.9，濃度為41.8 ng/μL。從RNA 變性電泳圖可以看出血小板總RNA 中miRNA 分布區(qū)的條帶清晰，無明顯降解（圖2）。

圖2 血小板總RNA的變性電泳圖Figure 2 Denaturation electrophoresis of platelet total RNA

2.4 兩組患者血小板miRNA表達(dá)譜差異

通過高通量測序發(fā)現(xiàn)兩組患者有95 種血小板miRNA 表達(dá)上存在顯著差異，其中顯著性下調(diào)的、差異倍數(shù)>2、拷貝數(shù)前20 位的miRNA 依次是hsa?miR?300、hsa?miR?151b、hsa?miR?1299、hsa?miR?16?1?3p、hsa?miR?3150b?3p、hsa?miR?548am?3p、hsa?miR?1260a、hsa?let?7f?2?3p、hsa?miR?4755?3p、hsa?miR?3144?3p、hsa?miR?5004?3p、hsa?miR?6862?5p、hsa?miR?1288?3p、hsa?miR?4661?5p、hsa?miR?4479、hsa?miR?4421、hsa?miR?6788?3p、hsa?miR?188?5p、hsa?miR?6874?3p、hsa?miR?218?5p（表3）。

表3 大于2倍拷貝數(shù)下調(diào)的miRNA（前20 位）Table 3 2?fold down?regulated miRNAs（top 20）

2.5 靶基因預(yù)測

通過靶基因預(yù)測軟件TargetScan、miRanda、PI?TA 和miRWalk 對上述顯著性下調(diào)的、差異倍數(shù)>2、拷貝數(shù)前20 位miRNA 的靶基因進(jìn)行預(yù)測，并從中篩選出至少被2個(gè)靶基因預(yù)測軟件預(yù)測對血小板聚集關(guān)鍵蛋白（P2Y12 受體、Gi2α蛋白、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體）可能有調(diào)控作用的miRNA；結(jié)果發(fā)現(xiàn)血小板miRNAs中的hsa?miR?188?5p、hsa?miR?6874?3p對P2Y12受體基因的表達(dá)可能具有調(diào)控作用；hsa?miR?218?5p、hsa?miR?3150b?3p、hsa?miR?1288?3p、hsa?miR?1299、hsa?miR?6862?5p 對Gi2α蛋白基因的表達(dá)可能具有調(diào)控作用；hsa?miR?6862?5p、hsa?miR?188?5p、hsa?miR?4421對血小板糖蛋白Ⅲa受體基因的表達(dá)可能具有調(diào)控作用；對于血小板糖蛋白Ⅱb受體，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)同時(shí)被至少被2 個(gè)靶基因預(yù)測軟件預(yù)測到的交集miRNA（表4）。

表4 血小板miRNA靶基因預(yù)測Table 4 Target gene prediction of platelet miRNA

3 討 論

目前，阿司匹林與氯吡格雷雙聯(lián)抗血小板治療被廣泛應(yīng)用于ACS患者［1，8-10］，較之新一代ADP受體拮抗劑替格瑞洛，氯吡格雷在年齡≥75 歲的老年患者、腎功能不全、血小板計(jì)數(shù)偏低等特殊ACS 患者中使用更為安全［11］。但研究發(fā)現(xiàn)在服用氯吡格雷常規(guī)劑量的患者中CLR發(fā)生率>20%［12］，且CLR患者血栓事件發(fā)生率顯著增高［5］。研究發(fā)現(xiàn)CLR與細(xì)胞色素P450 2C19（cytochrome P450 2C19，CYP2C19）基因多態(tài)性、糖尿病、吸煙、肥胖、腎功能不全、血清堿性磷酸酶、血尿酸等多種因素相關(guān)［13-18］，但基因變異等已知因素僅可解釋約12%的個(gè)體反應(yīng)差異，探討CLR的未知相關(guān)因素一直是近年來的研究熱點(diǎn)。

Chen等［19］發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，支架植入術(shù)后接受抗血小板治療（阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷或替格瑞洛或西洛他唑）的患者中miR?365?3p表達(dá)水平與抗血小板治療的反應(yīng)性相關(guān)；Chen S 等通過檢測血管舒張刺激磷蛋白計(jì)算血小板反應(yīng)指數(shù)來評價(jià)健康對照與介入治療術(shù)后冠心病患者對氯吡格雷的反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)miRNA?26a 與氯吡格雷低反應(yīng)性相關(guān)［20］；Nagalla 等［6］發(fā)現(xiàn)在血小板高反應(yīng)與正常反應(yīng)的健康人中有74種血小板miRNA 存在表達(dá)水平的差異，并發(fā)現(xiàn)miR?200b、miR?495和miR?107可通過特異性識(shí)別各自的靶mRNA 來調(diào)控血小板相應(yīng)蛋白的表達(dá)。因入選對象、血小板miRNA 提取方法、血小板功能檢測方法、miRNA 測序方法等存在差異，上述不同研究篩選出的與血小板反應(yīng)性相關(guān)的血小板miRNA不盡相同。

本研究通過如下方面在一定程度上避免了相關(guān)偏倚對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響：①參考相關(guān)研究共入選38例CAD患者［6］，氯吡格雷低反應(yīng)組與對照組患者的臨床基線特征與生化指標(biāo)均無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②采取了免疫磁珠法高效地純化血小板后，提取的血小板miRNA又經(jīng)Nanodrop分光光度計(jì)及變性電泳質(zhì)控。③采用的光比濁法血小板功能檢測可特異性地反映ADP通道被抑制的水平［21］，是目前血小板聚集功能檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”［22］，也是國際相關(guān)共識(shí)推薦的檢測方法之一［23］。POPULAR 研究比較了光比濁法、VerifyNow P2Y12、Plateletworks、IMPACT?R、PFA?100、改良PFA P2Y 共6 種血小板功能檢測方法，結(jié)果提示，光比濁法是對臨床終點(diǎn)有預(yù)測價(jià)值的3種血小板功能檢測方法之一［24］。④選取的Illumina HiSeq 2500 測序平臺(tái)是一個(gè)功能強(qiáng)大的高通量測序系統(tǒng)，可獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，是目前高通量測序領(lǐng)域主導(dǎo)的檢測方法之一［25］。

與對照組相比，CLR患者中有95種血小板miR?NA 表達(dá)上存在顯著差異；通過查詢靶基因預(yù)測軟件TargetScan、miRanda、PITA 和miRWalk，篩選出了至少被2個(gè)靶基因預(yù)測軟件預(yù)測對血小板聚集關(guān)鍵蛋白（P2Y12 受體、Gi2α蛋白、血小板糖蛋白IIb/IIIa受體）可能有調(diào)控作用的miRNA。在這些miRNA中，已有研究證實(shí)miR?218?5p 與凝血功能相關(guān)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究［26］。這些差異表達(dá)的miRNAs 有望成為血小板反應(yīng)性特異性生物學(xué)標(biāo)志物，也可能用于預(yù)測作用于相同位點(diǎn)的新型抗血小板藥物的反應(yīng)性。

綜上所述，本研究通過高通量測序探討了CLR的CAD患者血小板miRNA的表達(dá)差異，并篩選出了8個(gè)對血小板聚集關(guān)鍵蛋白可能有調(diào)控作用的miR?NA。隨著血小板miRNA 對血小板和其他細(xì)胞（包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等）以及l(fā)ncRNA（long non?coding RNA）、circRNA、miRNA、mRNA 之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)一步完善，miRNA在抗栓治療中的調(diào)控作用可能會(huì)為個(gè)體化抗血小板治療提供新的干預(yù)手段，值得進(jìn)一步深入研究。