邵慧靜，王天俊，張嘉嘉，楊娜娜，孫麗洲

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，江蘇 南京 210029

子癇前期（preeclampsia）是一種妊娠期特有疾病，主要表現(xiàn)為妊娠20周后出現(xiàn)高血壓并伴隨有蛋白尿，嚴(yán)重危害母兒健康［1］，如不及時(shí)管理，母體可能會(huì)出現(xiàn)高血壓、腎損傷、肝損傷、中樞神經(jīng)損傷、卒中、心肌病、肺水腫等并發(fā)癥，胎兒則有發(fā)生宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、胎盤(pán)早剝、早產(chǎn)、新生兒呼吸窘迫征等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。目前子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，普遍認(rèn)為胎盤(pán)占中心地位，唯一的解決辦法是盡早終止妊娠［2］。妊娠初期，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲子宮內(nèi)膜和淺肌層，重塑螺旋動(dòng)脈，使其由高阻低流型轉(zhuǎn)化為低阻高流型，從而提供胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的供血需求［3］。而在子癇前期患者的胎盤(pán)中，出現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足，部分螺旋動(dòng)脈重塑失敗，未轉(zhuǎn)化的螺旋動(dòng)脈出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化等病理改變［4］。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS/MS）技術(shù)為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供了有力工具，在尋找與特定疾病相關(guān)的蛋白、多肽、小分子代謝物過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［5］。多肽組學(xué)就是以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一門(mén)全面研究?jī)?nèi)源性多肽結(jié)構(gòu)、功能及變化規(guī)律的學(xué)科，是目前的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。內(nèi)源性多肽是指相對(duì)分子質(zhì)量小于10 kDa的小分子物質(zhì)，大多來(lái)自蛋白的降解，也可由基因直接翻譯而來(lái)［6］。此前認(rèn)為多肽僅僅是降解產(chǎn)物而無(wú)生物學(xué)活性，但越來(lái)越多的研究表明這些內(nèi)源性多肽也能引起相應(yīng)新陳代謝活動(dòng)的改變，因此多肽組學(xué)研究對(duì)于了解疾病發(fā)生機(jī)制、標(biāo)志物篩選及治療具有重要意義，已廣泛應(yīng)用于多種疾病如肥胖、糖尿病、腫瘤的研究［7-9］。在子癇前期的多肽組學(xué)研究中，目前已有子癇前期血清、尿液以及羊水多肽組學(xué)，為了解子癇前期的發(fā)病以及尋找特異性標(biāo)志物提供了重要的線索［10-12］。而胎盤(pán)作為子癇前期發(fā)病的起源器官，在多肽組學(xué)的水平上還未被研究。本文利用LC?MS/MS技術(shù)研究了子癇前期胎盤(pán)樣本中多肽組的特征性變化，并通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)了來(lái)自差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，為子癇前期發(fā)病機(jī)制研究以及治療提供了支持。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇2019 年5—9 月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩孕婦8 例，其中4 例正常足月妊娠，4例子癇前期病例。參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版教材對(duì)子癇前期的診斷，即妊娠20 周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg 和/或舒張壓≥90 mmHg，伴尿蛋白陽(yáng)性?；驘o(wú)蛋白尿但合并以下任何一項(xiàng)者：血小板減少；肝功能異常；腎功能損害；肺水腫；新發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常或視覺(jué)障礙。同時(shí)排除既往患高血壓、糖尿病、甲狀腺功能異常、妊娠期肝內(nèi)膽汁瘀積癥、肝臟以及腎臟疾病等合并癥的孕婦。研究對(duì)象均無(wú)吸煙史以及長(zhǎng)期服藥史。所有患者均為剖宮產(chǎn)，分娩后留取胎盤(pán)組織并迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至液氮保存。本研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)并同意自愿捐獻(xiàn)少許胎盤(pán)組織標(biāo)本。

離心超濾管（Millipore公司，美國(guó)）；純水、乙腈、甲酸、三氟乙酸（Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó)）；碳酸氫銨（Sigma 公司，美國(guó)）；胎牛血清、ECM培養(yǎng)基（Sciencell公司，美國(guó)）；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶?EDTA、PBS 緩沖液（Gibco 公司，美國(guó)）；CCK?8試劑盒、BCA 試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)公司）；Matrigel基質(zhì)膠（Corning公司，美國(guó)）；抗MMP?2兔一抗（武漢Proteintech 公司）、抗TIMP1 兔一抗、抗GAPDH鼠一抗（Abcam公司，美國(guó)）。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；多肽委托上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣?，通過(guò)RPLC?MS 檢測(cè)其純度為95%以上；人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系（HTR8/SVneo）以及臍靜脈內(nèi)皮（HUVECs）細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 樣本預(yù)處理

胎盤(pán)樣本采集后立即保存于液氮中。胎盤(pán)內(nèi)源性多肽的提取采用超濾離心法。具體操作流程如下：預(yù)冷研磨器具及其他需要接觸到樣品的工具，加入液氮進(jìn)行研磨，將冷凍粉末轉(zhuǎn)移至EP 管中。在樣品粉末中加入2 mL 提取液（1%甲酸水溶液），冰上超聲10 min 裂解。超聲后，4 ℃，20 000g離心30 min，取上清。吸取200 μL 樣品溶液使用10 kDa超濾管10 000g下超濾至20 μL，添加100 μL 50 mmol/L 碳酸氫銨，繼續(xù)超濾至20 μL，收集濾過(guò)液體，舍棄超濾管中分子量大于10 kDa的蛋白等大分子。使用200 μL 0.1% TFA，80% 乙腈活化除鹽柱。使用400～600 μL 0.1%TFA，1%乙腈溶液平衡除鹽柱。將樣品加入除鹽柱內(nèi)，使樣品緩慢流過(guò)除鹽柱，多肽被除鹽柱捕集，鹽等其他非疏水性小分子流出舍棄。再添加200 μL 0.1%三氟乙酸，0.5%乙腈溶液清洗除鹽柱，洗去殘留鹽類(lèi)，添加300 μL 0.1%三氟乙酸，80%乙腈溶液，使液體緩慢流過(guò)除鹽柱，將多肽洗脫下來(lái)，使用新EP管收集洗脫溶液，洗脫液冷凍干燥。

1.2.2 LC?MS/MS分析

色譜條件：采用NanoAcuity 超高壓納升級(jí)液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。液相A 液為0.1%甲酸?水溶液，B液為0.1%甲酸?乙腈溶液。樣品以200 μL A相溶解，由自動(dòng)進(jìn)樣器吸取2 μL樣品后，以10 μL/min流速傳送到捕集柱上捕集2 min。捕集柱上的樣品在分析柱上進(jìn)行色譜分離，流速為300 nL/min。相關(guān)液相梯度為0～105 min，B 液線性梯度從5% 到30%；105～110 min，B 液線性梯度從30% 到90%；110～112 min，B 液維持在90%；112～113 min，B 液線性梯度從90%到5%；B液保持5%7 min。樣本間用空白溶劑30 min流動(dòng)相梯度清洗1次。

質(zhì)譜條件：Q Exative HF 質(zhì)譜儀離子源噴霧電壓為2.0 kV，加熱毛細(xì)管設(shè)定為300 ℃，采用數(shù)據(jù)依賴(lài)模式自動(dòng)在MS 和MS/MS 間切換采集。全掃描MS 使用Orbitrap 進(jìn)行一級(jí)掃描，掃描范圍為m/z 350～1 600，分辨率設(shè)定為60 000（m/z 200處）。離子最大引入時(shí)間為50 ms，自動(dòng)增益控制（automatic gain control，AGC）設(shè)定為3×106，隨后使用高能碰撞解離（higher energy C?trap dissociation，HCD）對(duì)符合串級(jí)（MS/MS）碎裂條件的強(qiáng)度前10 名母離子進(jìn)行碎裂并用orbitrap 進(jìn)行掃描，掃描分辨率設(shè)定為15 000。掃描范圍根據(jù)母離子質(zhì)荷比自動(dòng)控制，最低掃描范圍固定為m/z=100處，最高到2 000。進(jìn)行MS/MS的最低離子強(qiáng)度值設(shè)定為50 000。MS/MS時(shí)離子最大引入時(shí)間為100 ms，AGC 控制設(shè)定為2.0×105，母離子選擇窗口設(shè)定為2 Da。對(duì)于2、3、4電荷數(shù)的離子進(jìn)行MS/MS采集，動(dòng)態(tài)排除設(shè)定為每個(gè)母離子在10 s 內(nèi)進(jìn)行1 次MS/MS，之后排除30 s，30%的碰撞能量。

1.2.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索分析

Q Exative HF 質(zhì)譜儀所采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用MaxQuant（Version 1.6.5.0）進(jìn)行搜索，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)（種屬：Homo sapiens，包含20 422條reviewed序列）。檢索參數(shù)設(shè)置為：甲硫氨酸殘基和天冬酰胺殘基為可變修飾；無(wú)酶切；一級(jí)質(zhì)譜精度（4.5 ppm）；二級(jí)質(zhì)譜精度（20 ppm）。多肽篩選門(mén)檻設(shè)定如下：假陽(yáng)性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于1%；蛋白最少匹配1條獨(dú)有肽段（unique peptides）；肽段最少包含7個(gè)氨基酸。多肽定量采用MaxQuant軟件（version 1.6.5.0）及iBAQ算法，F(xiàn)DR設(shè)置為0.01。

1.2.4 生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用在線工具（http：//web.expasy.org/compute）分析多肽的分子量和等電點(diǎn)分布情況。并利用GO（http：//geneontology.org）和 KEGG（http：//www.ge?nome.jp/kegg）分別對(duì)差異肽段匹配的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能富集分析和通路富集分析。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及多肽處理

HTR?8/SVneo 在含有10% FBS 的DMEM 中培養(yǎng)。HUVECs 在含有10% FBS 的ECM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩者均置于37 ℃、5%CO2的潮濕恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。多肽干粉用高壓蒸餾水溶解至終濃度為10 mmol/L 保存，使用前稀釋至相應(yīng)濃度。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組用50 μmol/L 濃度的多肽處理，對(duì)照組加入等量的高壓蒸餾水，隨后兩組同時(shí)置于37 ℃、5%CO2的潮濕恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 CCK?8法測(cè)定細(xì)胞增殖能力

多肽處理HTR?8/SVneo 細(xì)胞24 h 后，10%FBS DMEM重懸細(xì)胞并將細(xì)胞接種到96孔板，每組設(shè)置5 個(gè)重復(fù)反應(yīng)孔，每孔2 000 個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后分別加入10 μL CCK?8試劑，孵育2 h后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)

多肽處理HTR?8/SVneo 細(xì)胞24 h 后，10%FBS DMEM 重懸細(xì)胞。隨后將細(xì)胞接種到6 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，每孔600 個(gè)細(xì)胞，10%FBS DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d。10 d 后，PBS 洗滌細(xì)胞3次，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。隨后在倒置顯微鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn)

多肽處理HTR?8/SVneo 細(xì)胞24 h 后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，隨后將細(xì)胞加入Transwell 小室，每組3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔，每孔3×104個(gè)細(xì)胞。下室加入10%FBS DMEM 培養(yǎng)基，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。終止培養(yǎng)后，棉簽擦去上室未穿膜細(xì)胞，甲醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡100 倍視野下隨機(jī)取5 個(gè)視野對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并取平均值進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.9 HUVECs細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)

多肽處理HUVECs細(xì)胞24 h后，10%FBS ECM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將基質(zhì)膠提前置于4 ℃融化，96孔板中每孔鋪膠50 μL 后放至37 ℃培養(yǎng)箱孵育40 min以上。然后將細(xì)胞均勻鋪入含基質(zhì)膠的96孔板中，每組3 個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔，每孔3×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)6～12 h 后置于倒置顯微鏡100 倍視野下觀察，計(jì)數(shù)管腔形成數(shù)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.10 qPCR

TRIzol 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，采用聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。引物序列如下：MMP2：5′?GCTCAGATCCGTGGTGAGAT?3′（正向），5′?GGTGCTGGCTGAGTAGATCC?3′（反向）；TIMP1：5′?AATTCCGACCTCGTCATCAG?3′（正向），5′?GTT?GTGGGACCTGTGGAAGT?3′（反向）；GAPDH：5′?GACTCATGACCACAGTCCATGC?3′（正向），5′?AGAGGCAGGGATGATGTTCTG?3′（反向）。最終結(jié)果以2-ΔΔCt計(jì)算。

1.2.11 Western blot

RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，隨后上樣進(jìn)行SDS?PAGE 電泳。然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液封閉液封閉1 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜（抗MMP2一抗、抗TIMP1一抗、抗GAPDH一抗?jié)舛染鶠?∶1 000），后室溫孵育二抗1 h（二抗?jié)舛葹?∶5 000），洗膜后ECL 發(fā)光法顯影。使用Image J 對(duì)條帶進(jìn)行半定量灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0和Graphpad prism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤(pán)樣本臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)納入研究的孕婦年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、孕周、收縮壓、舒張壓、蛋白尿、胎兒出生體重、Aparg評(píng)分等臨床信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表1）。

表1 胎盤(pán)樣本的臨床信息Table 1 Clinical characteristics between preeclampsia and healthy pregnancies（）

表1 胎盤(pán)樣本的臨床信息Table 1 Clinical characteristics between preeclampsia and healthy pregnancies（）

2.2 胎盤(pán)樣本多肽組分的質(zhì)譜分析

通過(guò)LC?MS/MS 共鑒定了3 582個(gè)多肽片段，來(lái)源于499個(gè)蛋白。檢測(cè)到的肽段分子量主要分布在1 000～1 800 Da（圖1A）；肽段等電點(diǎn)主要分布在8.0～11.0（圖1B）；結(jié)合分子量的因素來(lái)看，肽段的分布并不均勻，主要集中在等電點(diǎn)為10.0左右的區(qū)域（圖1C）。

圖1 液相色譜?質(zhì)譜鑒定的胎盤(pán)多肽性質(zhì)分析Figure 1 Characteristics of placental peptide identified by liquid chromatography?tandem mass spectrometry（LC?MS/MS）

2.3 差異性多肽鑒定與篩選

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選差異多肽，差異多肽篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05 且Fold?change 值<0.83 或者>1.2，共篩選出48條差異多肽。其中18條多肽在子癇前期中上調(diào)，30條多肽在子癇前期中下調(diào)（表2）。

表2 多肽差異性表達(dá)Table 2 Differentially expressed peptides secreted from normal and preeclamptic placentas

2.4 胎盤(pán)差異性多肽所匹配蛋白質(zhì)的生物學(xué)分析

2.4.1 GO功能分析

通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異多肽所對(duì)應(yīng)的前體蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋分析（圖2）。結(jié)果表明，這些前體蛋白的功能類(lèi)別主要涉及分子的結(jié)合，包括蛋白結(jié)合、DNA 與RNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以及有機(jī)環(huán)狀化合物的結(jié)合，此外還涉及抗氧化以及分子載體的功能。這些蛋白多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中，還有一部分位于細(xì)胞外以及細(xì)胞核中。所參與的生物學(xué)過(guò)程主要包括代謝、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、生物合成以及免疫應(yīng)答等。

圖2 差異多肽所匹配的蛋白質(zhì)的GO分析Figure 2 GO analysis of the differential peptide matched proteins

2.4.2 KEGG信號(hào)通路分析

對(duì)差異多肽的前體蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示這些蛋白質(zhì)主要富集在凝血（coagula?tion cascade）、補(bǔ)體（complement cascade）和血小板激活（platelet activation）通路中。其中涉及AIAT 蛋白（又稱(chēng)SERPINA）、FIBA 蛋白（又稱(chēng)FGA）以及Ac?tin蛋白。

2.5 差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418的體外功能實(shí)驗(yàn)

選擇了下調(diào)多肽405SPLFMGKVVNPTQK418進(jìn)行研究，該多肽是SERPINA1 蛋白的C 端多肽，含有14 個(gè)氨基酸。根據(jù)此前研究報(bào)道，SERPINA1 在子癇前期孕婦的血清、尿液以及胎盤(pán)中表達(dá)上調(diào)。因此猜測(cè)，SERPINA1 以及其多肽可能在子癇前期的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮一定作用。而絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞功能減退以及螺旋動(dòng)脈重塑不足是子癇前期的主要發(fā)病因素，因此在滋養(yǎng)細(xì)胞以及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中研究該多肽的作用。

2.5.1 差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖以及遷移能力的影響

與對(duì)照組相比，多肽處理后的HTR?8/SVneo 細(xì)胞增殖能力顯著增加（P<0.01，圖3A）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)證實(shí)多肽處理后，HTR?8/SVneo 細(xì)胞生長(zhǎng)活力較空載對(duì)照組增加（P<0.01，圖3B）。此外，Tran?swell 實(shí)驗(yàn)證明了多肽處理后的HTR?8/SVneo 細(xì)胞較空載對(duì)照組的遷移能力增加（P<0.01，圖3C）。

圖3 多肽處理HTR?8/SVneo細(xì)胞后CCK?8、克隆形成及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 3 Effects of peptide on the proliferation and migration capacity of HTR?8/SVneo cells detected by CCK?8，colony formation assay and transwell assays

2.5.2 差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418能夠促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管狀形成

與空載對(duì)照組相比，多肽處理后HUVECs的管狀形成能力顯著增加（P<0.01，圖4）。

圖4 多肽處理HUVECs 細(xì)胞后對(duì)其管狀形成能力影響（×100）Figure 4 Effects of peptide on the tube formation capaci?ty of HUVECs（×100）

2.5.3 差異多肽405SPLFMGKVVNPTQK418處理后HTR?8/SVneo細(xì)胞中MMP2和TIMP1的表達(dá)

qPCR 以及Western blot 結(jié)果顯示，差異多肽處理后的HTR?8/SVneo細(xì)胞中MMP2的基因及蛋白水平明顯上調(diào)，而TIMP1 的基因以及蛋白水平則明顯下調(diào)（P<0.01，圖5）。

圖5 多肽處理后HTR?8/SVneo細(xì)胞中MMP2蛋白以及TIMP1 mRNA以及蛋白的表達(dá)情況Figure 5 Expression of MMP2 and TIMP1 in HTR?8/SVneo cells after peptide treatment

3 討論

本研究首次以子癇前期胎盤(pán)為樣本進(jìn)行多肽組學(xué)層面的研究，通過(guò)對(duì)子癇前期以及正常孕婦胎盤(pán)樣本的內(nèi)源性多肽組的分析，篩選出了48條差異性多肽。這些差異多肽反映了子癇前期狀態(tài)下胎盤(pán)內(nèi)蛋白的合成、加工和降解過(guò)程的變化，因此我們對(duì)這些差異多肽的前體蛋白進(jìn)行GO功能分析以及KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些前體蛋白主要與補(bǔ)體、凝血以及血小板激活通路密切相關(guān)，為子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究提供了方向以及依據(jù)。此外，多肽往往在臨床癥狀出現(xiàn)之前就已經(jīng)發(fā)生變化，因此可以將胎盤(pán)差異多肽與此前子癇前期尿液、血液以及羊水差異多肽聯(lián)合分析，尋找特異性生物標(biāo)志物以提高對(duì)子癇前期早期診斷率。

此外，多肽雖為蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)具有抗菌抗癌作用的多肽［13］。此前還發(fā)現(xiàn)多肽對(duì)于基因表達(dá)、物質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用，比如，早期研究認(rèn)為C肽（含有31個(gè)氨基酸）無(wú)生物學(xué)活性，且由于其不通過(guò)肝酶代謝，清除緩慢，將C 肽作為臨床判斷胰島β細(xì)胞功能的良好指標(biāo)。但近年來(lái)多項(xiàng)基礎(chǔ)以及臨床研究發(fā)現(xiàn)C肽具有重要的生物活性作用，如可以調(diào)節(jié)糖代謝，改善糖尿病微血管病變以及糖尿病神經(jīng)病變［14］。本研究在差異多肽中挑選了來(lái)自SERPINA1蛋白的C端多肽405SPLFMGKVVNPTQK418，該多肽位于SERPI?NA1 的C 端末端，由最后的14 個(gè)氨基酸組成，此前未有相關(guān)研究報(bào)道。而其前體蛋白SERPINA1被報(bào)道在子癇前期的尿液、血液以及胎盤(pán)中表達(dá)上調(diào)，表明該多肽有參與子癇前期發(fā)病的可能［15］。通過(guò)體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該多肽確實(shí)能促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、遷移以及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成，由此推測(cè)該多肽在子癇前期的發(fā)病中起保護(hù)性作用。

MMPs是一類(lèi)能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的金屬蛋白水解酶，TIMPs 為體內(nèi)細(xì)胞分泌的一類(lèi)能夠選擇性抑制MMPs活性的家族蛋白。在正常妊娠過(guò)程中兩者相互作用、相互制約以維持胎盤(pán)的正常功能。子癇前期的發(fā)病過(guò)程中，MMPs 以及TIMPs 發(fā)生異常表達(dá)，相關(guān)的發(fā)病機(jī)制涉及滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移侵襲以及血管內(nèi)皮功能失調(diào)。Li 等［16］檢測(cè)子癇前期大鼠模型中MMPs 所對(duì)應(yīng)底物的變化，發(fā)現(xiàn)與正常妊娠大鼠相比，子癇前期模型大鼠的胎盤(pán)以及主動(dòng)脈中的膠原含量增加，從而阻礙滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，MMPs 可以將大分子內(nèi)皮素降解為ET1?32，后者具有舒張血管的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠大鼠相比，子癇前期模型大鼠中的MMPs 以及ET1?32表達(dá)減少，從而使其介導(dǎo)的血管舒張作用減少，導(dǎo)致血管收縮和血壓增高［17］。本研究通過(guò)qPCR以及Western blot方法發(fā)現(xiàn)多肽405SPLFMGKV?VNPTQK418處理后的滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP2 表達(dá)量上調(diào)，而TIMP1表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明差異多肽405SPLFMG?KVVNPTQK418可能通過(guò)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲以及保護(hù)血管內(nèi)皮功能而起到緩解子癇前期發(fā)生發(fā)展的作用。

但子癇前期的發(fā)病是多種因素共同作用的結(jié)果，本研究也僅通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步探究了子癇前期胎盤(pán)多肽的變化以及差異多肽的潛在功能。多肽影響子癇前期發(fā)病的具體機(jī)制以及其他胎盤(pán)差異多肽的生物活性還需進(jìn)一步研究。此外，本研究在選擇臨床樣本時(shí)主要考慮了子癇前期這一變量因素，而忽略了孕周對(duì)于多肽組學(xué)可能的潛在影響，存在對(duì)照組以及子癇前期組孕周不匹配的情況。因此在未來(lái)研究中，將會(huì)選取更加合適的對(duì)照組，如孕周為非足月臀位破水剖宮產(chǎn)（排除感染因素）以及非足月前置胎盤(pán)伴出血剖宮產(chǎn)進(jìn)行研究。從而為子癇前期發(fā)病機(jī)制研究以及子癇前期的治療提供更多有效的線索。