許 靜,饒 旭，李 晶，王殿波

(1.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065; 2.西安市新城區(qū)綠化隊，陜西 西安 710043；3. 陜西農(nóng)塔生物數(shù)據(jù)研究有限公司，陜西 西安 710025)

0 前言

海藻糖最早是在1882年由Wiggers等從黑麥的麥角菌中分離得到一種非還原性雙糖，目前發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于真菌、細菌及植物和無脊椎動物體內(nèi)[1]。在植物體內(nèi)，海藻糖作為一種典型的細胞應(yīng)急代謝產(chǎn)物，當(dāng)細胞處于冷凍、高溫、干燥等不良環(huán)境時可被大量合成從而起到保護植物的作用[2]，在生存條件適宜時又可被迅速分解。在不同類型、不同程度的不良條件下，海藻糖合成的量不同，所以生物體內(nèi)的海藻糖含量可作為生物抗逆性水平的重要指標(biāo)[3]。鑒于海藻糖在抗凍、抗高溫、抗干旱、抗鹽堿等抗逆性上有重要調(diào)控作用，在植物育種中可以高表達海藻糖合成酶基因，有望得到抗旱、抗寒、耐鹽等具有抗逆性的新品種。如Garg 等將大腸桿菌海藻糖合成基因OtsA和OtsB構(gòu)建融合基因并置于脅迫誘導(dǎo)啟動子控制下轉(zhuǎn)入水稻中，該轉(zhuǎn)基因水稻在寒冷等非生物脅迫環(huán)境下積累的海藻糖是非轉(zhuǎn)基因植株的3～10倍, 且生長狀態(tài)遠好于非轉(zhuǎn)基因水稻[4]。此外，外源施用海藻糖也能提高植物的抗逆性，如謝冬微等研究表明，在低溫處理下，外源噴施海藻糖可提高小麥的相對含水量、脯氨酸含量和可溶性糖含量，降低丙二醛含量，緩解低溫脅迫的損傷[5]。

黃瓜是重要的大棚養(yǎng)殖蔬菜，一年四季供于餐桌。黃瓜是喜溫作物,在春季容易遭受倒春寒引起凍傷,前期低溫冷害是影響黃瓜產(chǎn)量和效益降低的主要原因。大棚黃瓜受冷害的襲擊,植株生長延緩,輕則減產(chǎn)12%～15%,重則整株死亡,減產(chǎn)達30%以上[6]，所以在生產(chǎn)過程中有必要施用一些抗凍產(chǎn)品對其進行保護。

因此，筆者研究通過測試一種海藻糖產(chǎn)品對黃瓜幼苗的抗凍性能的影響，并檢測葉片內(nèi)三種抗逆相關(guān)酶的活性變化，從而了解海藻糖的作用機理，為黃瓜田間生產(chǎn)涉及的防凍措施提供一定的思路和理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

實驗所用黃瓜種子為翠綠品種，購于京東商城。

實驗所用海藻糖為海愛佳(ALGAFlex品牌)水劑，用無菌水稀釋500倍后噴灑使用。過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)三種酶活性檢測試劑盒購于索萊寶科技有限公司，其它試劑均購于國藥。

1.2 黃瓜栽種方法及處理方法

購買的黃瓜種子在25℃黑暗條件下發(fā)芽后轉(zhuǎn)至花卉營養(yǎng)土上，置于西安文理學(xué)院溫室內(nèi)(自然光照， 15～30℃)培養(yǎng)4周，每周澆水2次。所有幼苗分為三組，每組各有9株植物，分別為空白對照組、陰性對照組、海藻糖組,每兩周向葉面噴灑海愛佳500倍稀釋液(海藻糖組)或無菌水(空白組和陰性對照組)至葉面有滾珠狀液滴。

1.3 冷凍處理

將所有植株從溫室移至實驗室，陰性對照組和海藻糖組幼苗全部置于4℃保鮮柜內(nèi)模擬凍害處理，空白對照組置于保鮮柜旁(室溫，10～20℃)，自然光照培養(yǎng)，期間每日觀察葉片萎蔫情況。

1.4 酶的活性檢測

冷凍處理第5天用直徑2 cm的打孔器在葉片上取樣，避開葉脈，每個葉片取4個圓孔，來自三株幼苗的葉片樣品混樣作為一個重復(fù)，每個處理有三個重復(fù)。所有樣品參照試劑盒使用說明操作檢測SOD、CAT和POD三種酶的活性。

1.5 凍害評估

第7天時取出所有植株，摘取所有真葉，并參照苗永美等所述方法對其進行凍傷評級并計算冷凍指數(shù)[7]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)使用Excell和SPSS 20進行分析和表格制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖產(chǎn)品增強了黃瓜幼苗的抗凍性能

冷凍處理5 d 后，陰性對照組黃瓜幼苗葉片開始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，冷凍處理7 d后，觀察到所有植株均出現(xiàn)不同程度的萎蔫癥狀，因此結(jié)束冷凍處理，取出所有植株。

如圖1所示，空白對照組葉片基本都呈無凍害的健康狀態(tài)，少數(shù)葉片出現(xiàn)輕微的萎蔫，可能是由夜間低溫或空氣干燥引起。而經(jīng)過冷凍處理的陰性對照組中，大部分葉片都出現(xiàn)了不同級別的凍害癥狀，說明實驗采取的冷凍處理有效，其中，無凍害癥狀的葉片占比17.5%、1級凍害占62.5%，2級占12.5%，3級和4級占比分別為5%和2.5%。而外源噴灑過海愛佳處理的植株葉片中無凍害癥狀的葉片占比51.36%、1級和2級各占24.35%和21.26%，3級僅占2.7%，無4級凍害，與陰性對照組呈現(xiàn)顯著差異，說明海愛佳提高了黃瓜幼苗的抗凍性。另外，如表1所示，經(jīng)海愛佳處理的植株冷凍指數(shù)明顯小于陰性對照組，與上述結(jié)論相符。

圖1 不同處理下黃瓜幼苗葉片的凍害評估。

表1 各處理下黃瓜幼苗葉片的冷凍指數(shù)

2.2 海藻糖產(chǎn)品提高了黃瓜葉片保護性酶的活性

如圖2所示，與空白對照相比，陰性對照樣品的POD酶活性明顯提高，再次說明筆者研究中冷凍處理有效。相比于陰性對照，海愛佳顯著提高了黃瓜幼苗葉片的CAT和POD兩種酶的活性，但SOD酶活性差異不顯著，說明海藻糖作用于CAT和POD，而不是SOD。

圖2 不同處理下黃瓜葉片中三種保護性酶的活性

3 討論

外源施用各種植物防凍產(chǎn)品是目前最主要和最有效的植物防凍方法。在眾多防凍產(chǎn)品中，海藻糖產(chǎn)品除了抗凍之外還兼有抗旱、抗鹽堿等抗其它逆境的功效，有研究還報道海藻糖可以促進植物的生理生長，因此受到越來越多的關(guān)注。筆者研究結(jié)果表明外源噴灑海藻糖產(chǎn)品海愛佳可提高黃瓜幼苗的抗凍性，這與文獻報道的海藻糖對植物抗凍性的作用一致。

植物體受到凍害時會增加體內(nèi)CAT、POD和SOD等抗氧化酶的合成，以清除活性氧和丙二醛等，從而防止這些物質(zhì)對細胞膜造成傷害[8]。SOD主要作用是清除植物體內(nèi)超氧陰離子轉(zhuǎn)化成過氧化氫，CAT和POD主要清除過氧化氫[9]。Ali等報道外源噴施海藻糖可提高干旱脅迫下玉米的POD和CAT活性[10]。相似地，王迪等報道海藻糖可以提高小麥體CAT活性，降低丙二醛和過氧化氫的含量[11]。因此，筆者研究也測定海愛佳對黃瓜葉片SOD、CAT和POD活性的影響，結(jié)果表明海藻糖提高了CAT和POD的活性，與上述研究結(jié)果一致。這些結(jié)果說明海藻糖產(chǎn)品通過提高CAT和POD兩種保護性酶的活性，從而增強了黃瓜幼苗的抗凍性。對黃瓜的田間生產(chǎn)來講，可在倒春寒來臨前，提前幾天噴灑海藻糖產(chǎn)品，即可幫助其提高抗凍性，減少凍害帶來的產(chǎn)量損失和經(jīng)濟損失。