妙孟姚，郭一暢，邵學(xué)廣，2，蔡文生

（1.南開(kāi)大學(xué)化學(xué)學(xué)院分析科學(xué)研究中心,天津市生物傳感與分子識(shí)別重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2.藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300071）

離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是細(xì)胞維持機(jī)體正常生命活動(dòng)的必要條件，其能夠調(diào)節(jié)膜電位并控制細(xì)胞對(duì)外界刺激產(chǎn)生的生物電反應(yīng)［1，2］.通常，離子需要膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)助進(jìn)而順電化學(xué)梯度跨膜轉(zhuǎn)運(yùn).細(xì)胞膜中由特殊親水性通道蛋白構(gòu)成的離子通道，能夠選擇性控制離子快速通過(guò)細(xì)胞膜［3~5］.近年來(lái)，以這些通道蛋白為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)出了一系列針對(duì)癲癇［6］、囊性纖維化［7］和癌癥［8］等疾病的治療劑.另一方面，也合成了多種類型的人工離子通道，如冠醚類［9］、柱芳烴類［10］、環(huán)糊精類［11］、葫蘆脲類［12］和多肽類［13］等，這類人工離子通道嵌插在細(xì)胞膜內(nèi)形成靜態(tài)的親水性通道，具有膜內(nèi)外傳輸離子的功能.除此以外，合成非通道型人工離子轉(zhuǎn)運(yùn)體以模仿離子通道蛋白的功能是另一個(gè)研究熱點(diǎn)，其中輪烷［14］作為離子轉(zhuǎn)運(yùn)體不同于這些靜態(tài)離子通道，其具有分子機(jī)器［15~18］的可控性和機(jī)械運(yùn)動(dòng)性，獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使其在離子跨膜運(yùn)輸領(lǐng)域的應(yīng)用成為一個(gè)有價(jià)值的課題.

基于輪烷設(shè)計(jì)的人工離子傳輸體系受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注.2018年，Chen等［14］首次合成了一個(gè)能實(shí)現(xiàn)離子跨磷脂雙分子層傳輸?shù)姆肿铀螅ǎ?］輪烷），該輪烷由大小兩個(gè)冠醚環(huán)連接而成的雙環(huán)系統(tǒng)和線性軸組成，其中大環(huán)套在一含有3個(gè)帶正電荷的結(jié)合位點(diǎn)的線性軸上，小環(huán)用于捕獲膜表面的K+.插入脂質(zhì)雙層膜后大環(huán)可在兩側(cè)結(jié)合位點(diǎn)之間來(lái)回運(yùn)動(dòng)，使得該分子梭就像纜車一樣，可以實(shí)現(xiàn)K+在生物膜兩側(cè)的不斷傳送.Credit［19］認(rèn)為該分子梭的成功合成預(yù)示著離子跨膜從被動(dòng)運(yùn)輸?shù)街鲃?dòng)運(yùn)輸?shù)闹卮笸黄?，為醫(yī)學(xué)治療和能量轉(zhuǎn)換提供了新的思路.Zeng等［20，21］基于該納米器件的擺動(dòng)原理，設(shè)計(jì)了一系列具備更高選擇性和活性的跨膜離子載體.我們［22］采用大規(guī)模分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬，首次在原子水平上探索了［2］輪烷在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中歷經(jīng)捕獲-轉(zhuǎn)運(yùn)-釋放的完整機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其鏈結(jié)構(gòu)中間帶正電的結(jié)合位點(diǎn)在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著重要作用，但該關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)對(duì)輪烷穿梭性質(zhì)及協(xié)助離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)行為的影響還缺乏一些細(xì)節(jié)的探究.

本文利用MD模擬結(jié)合高效的自由能計(jì)算方法研究了3種溶劑環(huán)境，即弱極性溶劑氯仿（CHCl3）、極性溶劑乙腈（CH3CN）、強(qiáng)極性溶劑水（H2O）及氯仿-乙腈（體積比1∶1）混合溶劑中輪烷（不攜帶K+）的穿梭路徑和能壘.對(duì)比研究了軸上中間結(jié)合位點(diǎn)去質(zhì)子化和質(zhì)子化兩種狀態(tài)下的輪烷的穿梭路徑和能壘.并進(jìn)一步設(shè)計(jì)了一種由水-氯仿-水構(gòu)成的“夾心”溶劑來(lái)模擬細(xì)胞膜環(huán)境，探索了中間位點(diǎn)不同質(zhì)子化狀態(tài)下小環(huán)載體攜帶K+在大環(huán)的帶動(dòng)下在細(xì)胞膜兩側(cè)穿梭的能壘變化和作用機(jī)制.

1 理論和方法

1.1 模型建立

［2］輪烷的兩種結(jié)構(gòu)如Scheme 1所示.輪烷的環(huán)狀部分包括一個(gè)苯并-24-冠-8的大環(huán)和一個(gè)苯并-18-冠-6的小環(huán)，大環(huán)可以套在兩親性的軸上進(jìn)行穿梭，小環(huán)被公認(rèn)為是具有高選擇性的K+載體.其中，輪烷1兩親性軸上的結(jié)合位點(diǎn)1和位點(diǎn)3各帶有一個(gè)正電荷，位點(diǎn)2由一個(gè)三氮唑環(huán)構(gòu)成，呈中性狀態(tài)；該位點(diǎn)被質(zhì)子化得到輪烷2，因此輪烷2共有3個(gè)帶正電的結(jié)合位點(diǎn).同時(shí)，兩親性基團(tuán)的距離與磷脂雙分子層的厚度一致，將該輪烷插入到膜內(nèi)可以形成穩(wěn)定的跨膜結(jié)構(gòu).Chen等［14］在氯仿和乙腈（體積比1∶1）的混合溶劑中測(cè)定了所研究輪烷的穿梭速率，盡管與真實(shí)細(xì)胞膜環(huán)境不完全相同，但他們認(rèn)為測(cè)得的結(jié)果能夠?yàn)榇蟓h(huán)滑動(dòng)以協(xié)助載體小環(huán)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)K+提供重要的參考.為了與實(shí)驗(yàn)條件一致，同樣選取氯仿-乙腈（體積比1∶1）混合溶劑來(lái)探索輪烷的基本性質(zhì).首先，為了探究不同溶劑對(duì)輪烷（不攜帶K+）運(yùn)動(dòng)過(guò)程的影響，將輪烷2插入到帶有周期性邊界條件的4種立方溶劑盒子中（表1中體系1~4）.為了探究軸上中間結(jié)合位點(diǎn)對(duì)輪烷（不攜帶K+）穿梭行為的影響，將輪烷1插入到相應(yīng)周期性溶劑盒子（表1中體系5）.考慮到輪烷嵌入脂質(zhì)雙層中穿梭或轉(zhuǎn)運(yùn)離子需要克服顯著的自由能壘，模擬時(shí)間長(zhǎng)，所以希望構(gòu)建一種細(xì)胞膜簡(jiǎn)化模型來(lái)高效模擬膜的性質(zhì).Smithrud等［23］選擇水和氯仿溶液分別代表細(xì)胞外的極性環(huán)境和細(xì)胞膜的脂質(zhì)部分，研究了輪烷類化合物參與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)藥物分子的機(jī)制.Wang等［24］認(rèn)為氯仿的疏水環(huán)境更接近磷脂雙分子層，并以此作為溶劑研究了輪烷異構(gòu)化對(duì)其穿梭速率的影響.基于此，為了研究中間位點(diǎn)不同質(zhì)子化狀態(tài)下輪烷攜帶K+跨膜的運(yùn)動(dòng)過(guò)程和機(jī)理，利用水-氯仿-水構(gòu)成的“夾心”溶劑來(lái)仿真模擬細(xì)胞膜，其中“夾心”氯仿的厚度與1-棕櫚酰-2-油酰-卵磷脂（POPC）雙層膜保持一致（約3.8 nm），保證位點(diǎn)1和位點(diǎn)3之間（約3.2 nm）處于疏水環(huán)境，兩親性基團(tuán)處于親水環(huán)境.此時(shí)，分別構(gòu)建體系6和7作為溶劑盒子（表1），K+始終約束在小環(huán)內(nèi).已有實(shí)驗(yàn)［14］和理論模擬［22］均表明輪烷在細(xì)胞膜內(nèi)可形成穩(wěn)定的垂直于細(xì)胞膜表面的跨膜結(jié)構(gòu)，因此，將輪烷垂直插入模擬細(xì)胞膜，質(zhì)心與膜的質(zhì)心重合，并將軸上的重原子約束在其伸展構(gòu)象以避免橫向擴(kuò)散和鏈的折疊.對(duì)上述所有體系，將經(jīng)過(guò)5000步的能量最小化以及60 ns的MD平衡模擬之后的結(jié)構(gòu)作為自由能計(jì)算的初始結(jié)構(gòu).此外，為了避免抗衡離子Cl?與輪烷的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生相互作用，它們始終被約束在溶劑盒子的邊緣位置.

Scheme 1 Artificial molecular shuttle of rotaxanes 1(A)and 2(B)

Table 1 Basic information of molecular assemblies investigated in this work

1.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

所有MD模擬均采用NAMD2.14軟件［25］，使用AMBER通用小分子力場(chǎng)（GAFF2）［26］和Lipid14力場(chǎng)［27］參數(shù)分別描述輪烷和抗衡離子；使用AMBER軟件提供的參數(shù)描述CHCl3，使用Cieplak等［28］提供的參數(shù)描述CH3CN；使用TIP3P模型［29］中的參數(shù)描述水分子.通過(guò)恒溫恒壓的Langevin動(dòng)力學(xué)方法將溫度保持在300 K，采用Langevin活塞方法將壓力控制在1.01×105Pa［30］.采用SETTLE算法保持水分子的剛性，采用SKAKE/RATTLE算法將所有涉及氫原子的共價(jià)鍵限制在其平衡值［31，32］.長(zhǎng)程靜電作用采用粒子網(wǎng)格埃瓦爾德（PME）方法［33］計(jì)算，范德華截?cái)喟霃綖?.9 nm.采用r-RESPA多時(shí)間步長(zhǎng)算法［34］，對(duì)運(yùn)動(dòng)方程積分的時(shí)間步長(zhǎng)為2和4 fs.采用VMD軟件［35］進(jìn)行軌跡分析.

1.3 自由能計(jì)算

自適應(yīng)偏置力（ABF）［36，37］方法是一種基于熱力學(xué)積分的重要采樣方法，通過(guò)在由集合變量構(gòu)成的反應(yīng)坐標(biāo)方向上施加偏置力來(lái)增強(qiáng)在該方向上的采樣，具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)氖諗啃裕谑褂弥写嬖诤芏嗑窒?，如ABF方法需要實(shí)現(xiàn)雅可比行列式的導(dǎo)數(shù)、集合變量間的相互獨(dú)立并與體系中存在的約束正交，大大限制了其在復(fù)雜體系中的應(yīng)用.為此，我們［38］實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)展自適應(yīng)偏置力（eABF）計(jì)算方法，基本解決了經(jīng)典ABF方法的缺點(diǎn).本文所有自由能計(jì)算均采用我們［39，40］在此基礎(chǔ)上最新發(fā)展的WTM-eABF方法，該方法結(jié)合了Well-tempered metadynamics［41，42］和eABF［38，43］“填谷”和“削峰”的優(yōu)點(diǎn)，極大提高了采樣效率，并已得到廣泛應(yīng)用［39，44］.計(jì)算所用反應(yīng)坐標(biāo)的定義如Scheme 1所示，d1為大環(huán)質(zhì)心與軸質(zhì)心之間的距離在z軸的投影，用來(lái)描述大環(huán)沿軸的穿梭運(yùn)動(dòng)，取值范圍為?1.8 nm≤d1≤1.8 nm；d2為小環(huán)質(zhì)心和大環(huán)質(zhì)心的距離在z軸的投影，用來(lái)描述載體相對(duì)車輪的擺動(dòng)情況，取值范圍為?1.5 nm≤d2≤1.5 nm.為了提高計(jì)算效率，反應(yīng)路徑沿d1被均分為6個(gè)窗口（?1.8 nm≤d1≤?1.2 nm，?1.2 nm≤d1≤?0.6 nm，?0.6 nm≤d1≤0 nm，0 nm≤d1≤0.6 nm，0.6 nm≤d1≤1.2 nm和1.2 nm≤d1≤1.8 nm），各窗口模擬時(shí)間基本相同.6個(gè)體系所用的模擬時(shí)間總計(jì)10.41 μs.首先計(jì)算沿（d1，d2）變化的二維自由能面，由于輪烷的結(jié)構(gòu)基本上是對(duì)稱的，所有顯示的二維自由能圖均為對(duì)稱化后的結(jié)果，然后采用多維最低能量算法（MULE）［39］在自由能面上確定輪烷在位點(diǎn)1和位點(diǎn)3之間穿梭的最低自由能路徑（LEFP）.定義S為描述路徑的有序參數(shù)，S=0和S=1分別代表LEFP中的初始狀態(tài)（位點(diǎn)1）和最終狀態(tài)（位點(diǎn)3），即可得到一維沿該路徑S的自由能變化圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑對(duì)輪烷穿梭運(yùn)動(dòng)的影響

圖1 （A）~（C）和（D）分別給出了輪烷2（不攜帶K+）在氯仿、乙腈和水溶劑中穿梭運(yùn)動(dòng)的二維自由能圖及在最低自由能路徑上的一維投影.自由能圖上的最低自由能路徑（黑線）代表了輪烷穿梭過(guò)程的最合理路徑.我們［45，46］的研究表明，這種靜電控制的分子梭的穿梭速度受環(huán)境極性的影響，極性升高，穿梭能壘降低，穿梭速度加快，特別是在水中，即水對(duì)輪烷穿梭起潤(rùn)滑作用［46］.對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在弱極性溶劑氯仿（極性4.4）、極性溶劑乙腈（極性6.2）和強(qiáng)極性溶劑水（極性10.2）中，輪烷的穿梭路徑和自由能變化趨勢(shì)相似，大環(huán)處于中間結(jié)合位點(diǎn)2時(shí)，小環(huán)發(fā)生擺動(dòng)（a2到a3，b2到b3，k2到k3），說(shuō)明在不同溶劑中輪烷的運(yùn)動(dòng)模式一致.在弱極性溶劑中，輪烷穿梭過(guò)程所需克服的能壘（ΔG）約為123.5 kJ/mol，說(shuō)明輪烷在氯仿溶劑中不會(huì)發(fā)生穿梭運(yùn)動(dòng).而在極性和強(qiáng)極性溶劑中，穿梭所需克服的能壘分別降至65.3和55.1 kJ/mol，此時(shí)大環(huán)在軸上可快速穿梭，說(shuō)明溶劑極性是影響輪烷穿梭過(guò)程中能壘高度和穿梭速率的一個(gè)重要因素.

Fig.1 Free?energy profiles and the lowest free energy pathway(LFEP,black line)underlying the shuttling movement of rotaxane 2 in CHCl3(A),CH3CN(B),H2O(C)and the corresponding free?energy change along the LFEPs(D)

Fig.2 Free?energy profile and the lowest free energy pathway(LFEP,black line)underlying the shuttling movement of rotaxane 2 in CHCl3 and CH3CN(volume ratio:1∶1)(A),the corresponding free?energy change along the LFEP(B)and representative spatial arrangements along the LFEP(C)

圖2 （A）~（C）分別給出了輪烷2（不攜帶K+）在氯仿-乙腈混合溶劑中穿梭過(guò)程的二維自由能圖、在最低自由能路徑上的一維投影及代表性結(jié)構(gòu)示意圖（其三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)本文支持信息圖S1）.大環(huán)帶動(dòng)小環(huán)在軸上滑動(dòng)需要克服的自由能壘估計(jì)為79.1 kJ/mol，與實(shí)驗(yàn)值（79.2 kJ/mol）［14］一致.對(duì)稱的兩個(gè)低能區(qū)域（藍(lán)色區(qū)域）代表了輪烷大環(huán)與軸上位點(diǎn)1和位點(diǎn)3的穩(wěn)定結(jié)合區(qū)域；兩個(gè)極小值點(diǎn)c1和c4代表了分子梭的兩種最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，由于冠醚易于與帶正電荷的基團(tuán)相互作用，當(dāng)大環(huán)處于位點(diǎn)1或位點(diǎn)3時(shí)，小環(huán)傾向于與位點(diǎn)2接觸，如圖2（C）所示；兩個(gè)能量相當(dāng)?shù)拇畏€(wěn)定點(diǎn)c2和c3，代表了大環(huán)穿梭到位點(diǎn)2時(shí)，小環(huán)相對(duì)大環(huán)的兩種擺動(dòng)，且對(duì)輪烷穿梭能壘無(wú)影響.此外，與圖1對(duì)比發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在混合溶劑或單一的不同極性溶劑中，輪烷的運(yùn)動(dòng)模式均沒(méi)有發(fā)生改變，位點(diǎn)2提供了大環(huán)穿梭過(guò)程中的次穩(wěn)定區(qū)域，此時(shí)小環(huán)的擺動(dòng)不影響大環(huán)穿梭的能壘.相比于輪烷在氯仿或乙腈中的穿梭能壘，發(fā)現(xiàn)其在混合溶劑中穿梭所需克服的能壘介于兩者之間，說(shuō)明隨著溶劑極性的增加，輪烷穿梭能壘降低.

2.2 中間結(jié)合位點(diǎn)的去質(zhì)子化對(duì)輪烷穿梭運(yùn)動(dòng)的影響

圖3 （A）~（C）分別給出了輪烷1（不攜帶K+）在氯仿-乙腈混合溶劑中穿梭運(yùn)動(dòng)的二維自由能圖、在最低自由能路徑上的一維投影及代表性結(jié)構(gòu)示意圖（其三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)本文支持信息圖S2）.大環(huán)在軸上滑動(dòng)所需克服的能壘約為73.3 kJ/mol.兩個(gè)顯著的低能區(qū)域（藍(lán)色區(qū)域）代表輪烷大環(huán)處于位點(diǎn)1和位點(diǎn)3時(shí)，小環(huán)相對(duì)大環(huán)的擺動(dòng)所需克服能壘較低；兩個(gè)極小值點(diǎn)e1和e4代表了輪烷穿梭運(yùn)動(dòng)中的最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，此時(shí)小環(huán)與大環(huán)質(zhì)心的連線傾向于垂直軸存在；兩個(gè)次穩(wěn)定點(diǎn)e2和e3代表了大環(huán)處于位點(diǎn)2時(shí)，小環(huán)傾向于與相鄰的帶一個(gè)正電荷的結(jié)合位點(diǎn)接觸，且擺動(dòng)對(duì)輪烷穿梭能壘影響較小.與圖2對(duì)比發(fā)現(xiàn)，軸上位點(diǎn)2去質(zhì)子化和質(zhì)子化的輪烷在混合溶劑中穿梭所需克服的能壘相差不大，兩種輪烷穿梭速率基本一致；在穿梭-擺動(dòng)-穿梭運(yùn)動(dòng)中，小環(huán)始終傾向于靠近相鄰的結(jié)合位點(diǎn)，這主要?dú)w因于載體冠醚傾向于與相鄰的帶正電荷的位點(diǎn)相互作用的固有特性，因此位點(diǎn)2的不同質(zhì)子化狀態(tài)是造成穿梭和擺動(dòng)協(xié)同運(yùn)動(dòng)過(guò)程中穩(wěn)態(tài)和亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象差異較大的主要原因.

Fig.3 Free?energy profile and the lowest free energy pathway(LFEP,black line)underlying the shuttling movement of rotaxane 1 in CHCl3 and CH3CN(volume ratio:1∶1)(A),the corresponding free?ener?gy change along the LFEP(B)and representative spatial arrangements along the LFEP(C)

2.3 中間位點(diǎn)的質(zhì)子化狀態(tài)對(duì)輪烷攜帶離子跨膜運(yùn)動(dòng)的影響

輪烷協(xié)助K+跨膜運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵步驟是其小環(huán)攜帶離子在大環(huán)的帶動(dòng)下在膜中的穿梭運(yùn)動(dòng).為了探究位點(diǎn)2質(zhì)子化狀態(tài)對(duì)輪烷攜帶離子跨膜運(yùn)動(dòng)的影響，分別對(duì)輪烷1和輪烷2的攜帶離子跨膜過(guò)程進(jìn)行了計(jì)算.圖4（A）~（C）分別給出了輪烷1攜帶K+在細(xì)胞膜簡(jiǎn)化模型中穿梭運(yùn)動(dòng)的二維自由能圖、在最低自由能路徑上的一維投影及代表性結(jié)構(gòu)示意圖（其三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)本文支持信息圖S3）.輪烷攜帶離子穿梭所需克服的能壘估計(jì)為134.1 kJ/mol.兩個(gè)對(duì)稱的低能區(qū)域（藍(lán)色區(qū)域）代表大環(huán)穩(wěn)定于位點(diǎn)1和位點(diǎn)3時(shí)，小環(huán)攜帶離子處于膜表面處的能量更有利；兩個(gè)極小值點(diǎn)f1和f4代表了納米機(jī)器轉(zhuǎn)運(yùn)離子過(guò)程中的兩種最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，如圖4（C）所示；兩個(gè)局部極值點(diǎn)f2和f3代表大環(huán)沿軸從位點(diǎn)2穿梭到位點(diǎn)3時(shí)，小環(huán)未發(fā)生擺動(dòng).總而言之，輪烷大環(huán)沿軸歷經(jīng)位點(diǎn)1→位點(diǎn)2→位點(diǎn)3的長(zhǎng)途運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，小環(huán)始終未發(fā)生上下擺動(dòng)，而當(dāng)大環(huán)停留在位點(diǎn)3時(shí)，小環(huán)向下擺動(dòng)停留在膜表面處.無(wú)協(xié)助K+在POPC磷脂雙層膜中滲透所需克服的能壘約為111 kJ/mol［47］，從圖4（B）可見(jiàn)，輪烷協(xié)助的離子跨膜傳輸所需克服的能壘遠(yuǎn)高于此值，說(shuō)明位點(diǎn)2去質(zhì)子化的輪烷難以跨膜傳輸K+.

Fig.4 Free?energy profile and the lowest free energy pathway(LFEP,black and white line)underlying the shuttling movement of rotaxane 1 with one K+in a simplified model of a biological membrane(A),the corresponding free?energy change along the LFEP(B)and representative spatial arrangements along the LFEP(C)

Fig.5 Free?energy profile and the lowest free energy pathway(LFEP,black line)underlying the shuttling move?ment of rotaxane 2 with one K+in a simplified model of a biological membrane(A),the corresponding free?energy change along the LFEP(B)and representative spatial arrangements along the LFEP(C)

圖5 （A）~（C）分別給出了輪烷2攜帶K+在細(xì)胞膜簡(jiǎn)化模型中穿梭運(yùn)動(dòng)的二維自由能圖、在最低自由能路徑上的一維投影及代表性結(jié)構(gòu)示意圖（其三維結(jié)構(gòu)見(jiàn)本文支持信息圖S4）.沿LFEP的自由能勢(shì)壘約為52.9 kJ/mol，相比于K+在POPC膜內(nèi)無(wú)協(xié)助傳輸［47］的能壘降低約58 kJ/mol，說(shuō)明該分子梭的運(yùn)動(dòng)加速了離子的傳輸速度.同時(shí)，與圖4對(duì)比發(fā)現(xiàn)，輪烷位點(diǎn)2質(zhì)子化后，其攜帶離子跨膜的自由能勢(shì)壘降低約81.2 kJ/mol，穿梭速率顯著提高，說(shuō)明“補(bǔ)給站”在輪烷跨膜傳輸離子過(guò)程中發(fā)揮了重要作用.兩個(gè)對(duì)稱的低能區(qū)域（藍(lán)色區(qū)域）代表大環(huán)處于位點(diǎn)1和位點(diǎn)3時(shí)，小環(huán)攜帶離子傾向于停留在膜表面處，結(jié)果與圖4一致；兩個(gè)極小值點(diǎn)g1和g4表明大環(huán)與軸上位點(diǎn)1或位點(diǎn)3結(jié)合時(shí)，小環(huán)攜帶K+處在膜表面的結(jié)構(gòu)是該分子梭的最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；兩個(gè)能量相當(dāng)?shù)拇畏€(wěn)定點(diǎn)代表大環(huán)處于位點(diǎn)2時(shí)，小環(huán)相對(duì)大環(huán)的上下兩種擺動(dòng)，且擺動(dòng)對(duì)穿梭能壘影響較大，結(jié)構(gòu)如圖5（C）所示.另外，與該輪烷不攜帶陽(yáng)離子在混合溶劑中穿梭運(yùn)動(dòng)（圖2）相比，兩種環(huán)境下輪烷的最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)有明顯差異，即小環(huán)攜帶K+后載體沒(méi)有傾向于接觸位點(diǎn)2，而是在膜界面處的能量更有利.

通過(guò)對(duì)輪烷2協(xié)助K+跨膜傳輸過(guò)程中的穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)和能壘進(jìn)行分析，整個(gè)穿梭過(guò)程包括穿梭-擺動(dòng)-穿梭3個(gè)步驟：（1）大環(huán)從軸上的結(jié)合位點(diǎn)1穿梭到位點(diǎn)2，此時(shí)小環(huán)處于膜表面；（2）大環(huán)保持在位點(diǎn)2，小環(huán)相對(duì)大環(huán)擺動(dòng)，使小環(huán)進(jìn)入到細(xì)胞膜的另一邊；（3）大環(huán)從位點(diǎn)2穿梭到位點(diǎn)3，并將離子載體推出細(xì)胞膜.因此，輪烷軸上質(zhì)子化的位點(diǎn)2誘發(fā)了小環(huán)相對(duì)大環(huán)的擺動(dòng)，將長(zhǎng)途穿梭運(yùn)動(dòng)切割為兩個(gè)短途穿梭，從而降低穿梭能壘，且大環(huán)穿梭和小環(huán)擺動(dòng)的協(xié)同運(yùn)動(dòng)在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用.2021年，Bao和Qu等［24］基于位點(diǎn)2在［2］輪烷穿梭運(yùn)動(dòng)中的重要作用，進(jìn)一步在該位點(diǎn)引入偶氮苯光致異構(gòu)基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)了仿生膜上可逆ON/OFF的光門(mén)控高效離子跨膜運(yùn)輸.圖6（A）和（B）分別給出了輪烷2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子過(guò)程中大環(huán)和軸以及小環(huán)-離子復(fù)合物和水之間靜電相互作用能（E）沿反應(yīng)坐標(biāo)的變化.結(jié)合LFEP可以明顯看出，大環(huán)在位點(diǎn)1和位點(diǎn)3之間穿梭（沿d1）的驅(qū)動(dòng)力是大環(huán)和軸上這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的靜電相互作用，而小環(huán)攜帶K+擺動(dòng)（沿d2）的驅(qū)動(dòng)力是小環(huán)-離子復(fù)合物和水的靜電相互作用.

Fig.6 Variation of the electrostatic interaction energy between the wheel and the axle(A),carrier?ion complex and H2O along the transition coordinate for the shuttling movement of rotaxane 2 with one K+(B)

需要指出的是，計(jì)算所得的穿梭能壘比在POPC雙層膜中的計(jì)算結(jié)果［22］要低約22 kJ/mol，但輪烷在攜帶K+穿越簡(jiǎn)化細(xì)胞膜過(guò)程中的穩(wěn)態(tài)/亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)、穿梭-擺動(dòng)-穿梭運(yùn)動(dòng)過(guò)程及協(xié)同作用機(jī)制，與其在POPC膜中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)K+的模擬結(jié)果一致，模擬時(shí)間是后者的近1/8.因此，利用水-氯仿-水構(gòu)成的“夾心”溶劑來(lái)模擬簡(jiǎn)化細(xì)胞膜，在保證磷脂雙分子層性質(zhì)的同時(shí)，又可以縮短模擬時(shí)間，大幅度提升計(jì)算效率.

3 結(jié) 論

采用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合高效先進(jìn)的自由能計(jì)算方法，研究了一個(gè)能夠協(xié)助K+跨膜運(yùn)動(dòng)的輪烷型分子梭，探索了溶劑環(huán)境及中間結(jié)合位點(diǎn)（位點(diǎn)2）的不同質(zhì)子化狀態(tài)對(duì)其（不攜帶K+）穿梭行為的影響.結(jié)果表明，對(duì)于氯仿、乙腈、水和氯仿-乙腈混合溶劑而言，溶劑的改變不影響輪烷穿梭運(yùn)動(dòng)的模式，但隨著溶劑極性的降低，輪烷穿梭過(guò)程所需克服的自由能能壘顯著增加，且在弱極性溶劑氯仿中，輪烷的穿梭行為極難發(fā)生；在混合溶劑中，位點(diǎn)2的質(zhì)子化和去質(zhì)子化不影響小環(huán)的擺動(dòng)及其穿梭能壘.進(jìn)一步探究了位點(diǎn)2對(duì)該輪烷攜帶K+跨膜（“夾心”溶劑）行為的影響，發(fā)現(xiàn)其質(zhì)子化后可以大幅度降低輪烷攜帶離子穿梭所需克服的能壘，提高離子轉(zhuǎn)運(yùn)速率，且?guī)д姷奈稽c(diǎn)2誘發(fā)了小環(huán)相對(duì)于大環(huán)的擺動(dòng)，兩種運(yùn)動(dòng)的協(xié)同，即穿梭-擺動(dòng)-穿梭，使大環(huán)在軸上的穿梭能壘降低，是其跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能得以實(shí)現(xiàn)的重要原因.基于本文的分子梭協(xié)助離子跨膜運(yùn)輸方式和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究，對(duì)計(jì)算機(jī)輔助人工離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的設(shè)計(jì)提出以下建議：（1）納米器件應(yīng)具有兩親性，其長(zhǎng)度應(yīng)該與膜的厚度一致，使其組裝到膜內(nèi)具有高度的穩(wěn)定性；（2）冠醚環(huán)的大小需要匹配不同陽(yáng)離子的尺寸，以實(shí)現(xiàn)人工轉(zhuǎn)運(yùn)體的離子選擇性；（3）納米器件不同組分在兩親性環(huán)境中的協(xié)同運(yùn)動(dòng)是提高穿梭速率不可忽略的因素；（4）利用分子梭對(duì)pH變化、光照、溫度、溶劑等的響應(yīng)，改變輪烷軸上結(jié)合位點(diǎn)的親和力，有望實(shí)現(xiàn)離子的可控定向傳輸.

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