王明霞，劉志輝，朱 鎮(zhèn)，李凌鋒，王博蔚

（1.吉林大學第二醫(yī)院,長春130021；2.吉林大學口腔醫(yī)院,長春130021；3.鎮(zhèn)江市口腔醫(yī)院,鎮(zhèn)江212001）

由于外傷、炎癥、腫瘤切除術、先天性骨骼發(fā)育畸形、骨再生異常、伴隨人口老齡化或全身疾病出現(xiàn)的骨萎縮和骨質疏松等都會導致臨床骨缺損［1］.隨著再生醫(yī)學的進步與組織工程學的發(fā)展，骨組織工程開始被廣泛研究［2］.支架材料作為骨組織工程中的關鍵角色，既為種子細胞和各種細胞因子提供了載體，又為新生骨組織生長營造了局部微環(huán)境，為細胞的黏附、增殖和組織的生長提供支持［3］，進而構建出作為缺損骨組織替代物的細胞-支架-生物因子復合體.本文將納米硅酸鎂鋰（nLMS）、殼聚糖（CS）和海藻酸鈉（SA）3種材料混合，制備了一種新型的nLMS-CS-SA復合支架材料，分析了其微觀形態(tài)與三維立體結構，檢測其溶脹率、孔隙率和降解速度，并通過與L929細胞體外共培養(yǎng)評價其生物相容性，探討了在nLMS-CS-SA復合支架材料中改變納米硅酸鎂鋰的含量對其理化性能和生物性能產生的影響.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖購自國藥集團化學試劑有限公司（脫乙酰度80.0%~95.0%，平均相對分子量10000）；海藻酸鈉（12～20 cp）購自美國Sigma公司；納米硅酸鎂鋰購自上海源葉公司；無水乙醇和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京化工廠；L929細胞系由吉林大學口腔實驗中心提供；H-DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；小牛血清購自Clark公司；胰酶購自北京鼎國昌盛公司；CCK-8試劑盒購自三邦醫(yī)藥公司.

CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；真空冷凍干燥機購自北京博醫(yī)康公司；S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM，束流：20 μA，電子加速電壓：5.0 kV，放大倍數(shù)：100倍和200倍）和E-1010型離子濺射儀購自日本Hitachi公司；酶標檢測儀購自美國Bio-TEK公司；ALPHA型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）購自德國Bruker公司（檢測范圍：600~4000 cm?1，分辨率：4 cm?1）；AG-X型電子萬能試驗機購自日本島津公司.

1.2 nLMS-CS-SA復合支架材料的制備

1.2.1 各組分水溶液的配制分別將1，2，3和4 g nLMS粉末充分溶解于100 mL去離子水中，制備質量分數(shù)為1%，2%，3%，4%的nLMS溶液；將4 g SA充分溶解于100 mL去離子水中，制備質量分數(shù)為4%的SA溶液；將6 g CS充分溶解于100 mL質量分數(shù)為2%的冰醋酸溶液中，制得質量分數(shù)為6%的CS溶液.

1.2.2 nLMS-CS-SA復合支架材料的制備將4 mL 1%（或2%，3%，4%）的nLMS溶液加入至12 mL 6%

的CS溶液中，于500 r/min轉速下攪拌30 min；將5 mL混合液在200 r/min轉速下緩慢加入到20 mL 4%的SA溶液中，用質量分數(shù)為4%的NaOH溶液調節(jié)體系pH值為7.0±0.5，反應完成后即制得透明凝膠狀復合材料；在100 W功率下超聲振蕩30 min后，于4℃冰箱中靜置2 h以排除氣泡.將上述凝膠狀材料按2.5 mL/孔的量加入24孔板中，放入?20℃冰箱冷凍24 h后再于?80℃冰箱冷凍24 h；然后置于凍干機中干燥24 h，即制得含有不同質量分數(shù)的nLMSH的nLMS-CS-SA多孔復合支架材料，記為xnLMSCS-SA（其中x代表所用nLSM溶液的質量分數(shù)）.

1.3 性能表征

1.3.1 溶脹率的測定稱量各組復合支架材料，記為m0（g）；將材料完全浸泡于PBS中0.5 h后用濕濾紙拭去表面水分并稱量其濕重，并記為mt（g）；于1，2，3，4，12，24和48 h重復上述操作，記錄每次測量時的質量變化.每組樣品設置3個平行檢測組.按下式計算nLMS-CS-SA復合支架材料的溶脹率：

1.3.2 孔隙率的測定將燒杯內裝滿無水乙醇并稱重，記為m1（g）；將經過充分凍干的質量為m0（g）的nLMS-CS-SA復合支架材料完全浸入其中，待完全浸透后再加滿無水乙醇稱重，記錄為m2（g）；將樣品取出后剩余的無水乙醇和燒杯質量記為m3（g）.每組設3個平行檢測組.孔隙率的計算公式如下：

1.3.3 體外降解性能測定將經過充分凍干的nLMS-CS-SA復合支架材料［質量記為w0（g）］，浸泡于PBS中，于37℃培養(yǎng)7 d后棄掉緩沖液，將剩余材料再次凍干［質量記為wt（g）］，更換新PBS溶液，連續(xù)重復上述步驟直至第7周.每組設置3個平行樣.體外降解性以質量損失分數(shù)表示，計算方法如下：

1.4 細胞相容性評價

1.4.1 細胞培養(yǎng)采用含10%小牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)小鼠成纖維細胞L929細胞系.

1.4.2 細胞毒性測試將充分滅菌后的nLMS-CS-SA復合支架材料放入50 mL離心管內，培養(yǎng)基體積與nLMS-CS-SA復合支架材料表面積比為0.9 mL∶1 cm2，使復合支架材料完全浸沒，于37℃培養(yǎng)72 h后收集離心管中液體，并在4℃冰箱中密封保存?zhèn)溆?將處于對數(shù)生長期的L929細胞重懸、計數(shù)并稀釋為10000 cell/mL，按2000 cell/孔將細胞接種于96孔板內.實驗共設置6組，5種nLMS-CS-SA復合支架材料浸提液作為實驗組，單純培養(yǎng)基作為對照組，每組設置8個平行孔.待細胞完全貼壁后，實驗組及空白對照組分別加入5種nLMS-CS-SA復合支架材料浸提液或細胞培養(yǎng)基，每孔200 μL.孵育48 h后棄去各孔內的上清液，實驗組及對照組每孔加入100 μL預先配制好的CCK-8混合液，孵育4 h后用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度值（OD）.利用相對增殖率［Relative growth rate（RGR），%］評價細胞毒性.計算公式如下：

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗所得數(shù)據采用ISM SPSS Statistics 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，當P＜0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義.使用Origin Pro 9.0，Microsoft Excel 2019和Adobe Photoshop CS6軟件進行圖像處理和圖表繪制.

2 結果與討論

2.1 nLMS-CS-SA復合支架材料的形態(tài)表征

圖1 示出了nLMS-CS-SA復合支架材料的宏觀形態(tài).宏觀條件下各組支架都具有可塑性.nLMSCS-SA復合支架材料凍干前為具有良好可塑性的凝膠狀，凍干后呈圓柱狀.直徑約1.5 cm，高約1.0～1.5 cm，顏色為乳白色，表面呈網格狀結構，具有疏松多孔的三維立體結構.

Fig.1 General view of nLMS?CS?SA composite scaffolds

2.2 傅里葉變換紅外光譜

圖2 給出不同nLMS含質量的nLMS-CS-SA復合支架材料的傅里葉變換紅外光譜.硅酸鎂鋰的Si—O和—OH振動吸收峰分別出現(xiàn)在1040和3400 cm?1附近［4，5］；殼聚糖中C—N鍵的特征峰出現(xiàn)在1159 cm?1處，酰胺鍵的特征峰出現(xiàn)在1647 cm?1處，伯氨鍵的特征峰出現(xiàn)在1578 cm?1附近，在3330 cm?1附近出現(xiàn)了O—H和N—H吸收峰［6，7］；1614 cm?1處為海藻酸鈉的C=O特征峰，—OH的伸縮振動峰為3305 cm?1處的寬峰，C—O振動峰出現(xiàn)在1029 cm?1處［7］；與空白對照組相比，5組實驗組未出現(xiàn)明顯的新吸收峰.在3%nLMS組中，SA的C=O特征峰與LMS向低波數(shù)方向移動的Si—O特征峰重疊，在1024 cm?1處出現(xiàn)增強的特征峰.3207 cm?1處增強的特征寬峰是由nLMS在3400 cm?1附近的—OH，SA在3305 cm?1處的—OH及CS在3330 cm?1附近的O—H，N—H吸收峰向低波移動并重疊而成.與Alif等［6］的研究相同，因nLMS的特征峰被1024和3207 cm?1處的拉伸振動所掩蓋并向低波數(shù)移動，故未觀察到明顯的nLMS特征峰.SA-CS與nLMS之間未發(fā)生化學反應，主要以氫鍵或分子間作用力結合.

Fig.2 FTIR spectra of nLMS?CS?SA scaffold materials

2.3 微觀結構與孔隙率

圖3 給出nLMS-CS-SA復合支架材料的SEM照片.由圖3可以看出，5組復合支架材料的內部均呈疏松多孔結構，連續(xù)分布于材料全層.縱斷面呈均勻片層狀，層間距基本均勻.微觀結構內具有高度的連通性，呈三維網絡狀.圖4給出nLMS-CS-SA復合支架材料的孔隙率結果.所有組的孔隙率均高于60%，當所用nLMS溶液的質量分數(shù)為1%～3%時，復合支架材料的孔隙率都低于空白組（P＜0.01）；當所用nLMS質量分數(shù)增加到4%時，nLMS-CS-SA復合支架材料的孔隙率急劇增大（P＜0.01）.

Fig.3 SEM images of nLMS?CS?SA scaffolds

Fig.4 Porosity ratios of nLMS?CS?SA composite scaffolds

Fig.5 Swelling ratios of nLMS?CS?SA composite scaffolds as a function of time

2.4 溶脹率

圖5 給出nLMS-CS-SA復合支架材料溶脹率隨時間的變化.各組材料均表現(xiàn)出相似的溶脹過程和優(yōu)秀的親水性，浸入水中后較快發(fā)生親水溶脹，且在1 h后溶脹速度變化基本趨于穩(wěn)定.圖6給出24 h時nLMS-CS-SA復合支架材料的溶脹率.由圖6可見，隨著nLMS含量逐漸增加，nLMS-CS-SA復合支架材料的溶脹率先降低后增高.2%nLMS-CS-SA和3%nLMS-CS-SA組的溶脹率均低于0nLMS-CS-SA組，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）.

Fig.6 Swelling ratios of nLMS?CS?SA composite scaffolds at 24 h

Fig.7 Mass loss curves of nLMS?CS?SA composite scaffolds in vitro

2.5 體外降解性能

圖7 給出nLMS-CS-SA復合支架材料的體外降解曲線.所有組別的降解曲線基本都呈線性，其中空白組支架的降解最快，在第28 d時降解率達到70%左右.當所用nLMS溶液的濃度在1%～3%區(qū)間內時，所制備的nLMS-CS-SA復合支架材料的降解率依次降低.4%nLMS-CS-SA的降解率介于1%nLMSCS-SA和2%nLMS-CS-SA組之間，3%nLMS-CS-SA的降解速率在第49 d時仍小于60%（P＜0.01）.

2.6 力學性能

圖8 給出所制備的nLMS-CS-SA復合支架材料的彈性模量.可以看出，加入nLMS后，在所測試區(qū)間內復合支架材料的彈性模量與nLMS的質量分數(shù)無明顯相關性.

Fig.8 Elastic modulus of nLMS?CS?SA composite scaffolds

Fig.9 RGR of nLMS?CS?SA composite support

2.7 生物相容性

檢測不同nLMS含量的nLMS-CS-SA復合支架材料浸提液培養(yǎng)的細胞在48 h時CCK-8的吸光度值并計算各個組的細胞相對增殖率（RGR）值，各組材料浸提液的細胞毒性結果見圖9.各組細胞增殖率差異無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其中，1%nLMS-CS-SA組（RGR=101.46%），2%nLMS-CS-SA組（RGR=104.73%），3%nLMS-CS-SA組（RGR=154.52%）和4%nLMS-CS-SA組（RGR=147.57%）細胞毒性為0級，0nLMS-CS-SA組RGR=98.73%的細胞毒性為1級.

2.8 討 論

在骨組織工程中，理想的骨支架材料應具有一定的機械強度、適宜的理化性能和良好的生物相容性［8，9］.大量研究表明，單一組分的骨支架材料往往功能單一，難以具備理想支架材料的性能［10］.將不同骨支架材料人工合成為復合材料可以彌補單一組分材料的不足.殼聚糖［11］和海藻酸鈉［12］形成的聚電解質天然高分子化合物以其良好的生物活性、無毒性及易降解等優(yōu)勢而被廣泛應用于骨組織工程領域，在骨重建與骨修復中展示出巨大潛能［5，13，14］.硅酸鎂鋰是一種人工合成的具有2D結構的納米級材料［15］.研究表明，硅酸鎂鋰能促進細胞的增殖、黏附及成骨分化.即使在不含成骨誘導因子的體外環(huán)境中，硅酸鎂鋰也能促進干細胞的成骨分化進程［16］.本文將兩種有機材料殼聚糖、海藻酸鈉與無機材料納米硅酸鎂鋰復合在一起，各物質間通過氫鍵及各種分子間作用力進行有機整合，最終制備出一種新型復合骨支架材料.

疏松多孔的骨支架材料有利于骨缺損的重建與修復.研究表明，在保證一定物理機械強度的條件下，支架的孔隙率應盡可能地大（一般認為應大于70%）.較高的孔隙率可提供足夠大的表面積，有利于細胞和支架的相互作用.大小適宜的孔徑和孔隙的貫通性既便于細胞的遷移擴散和新生組織結構的生長，又有利于營養(yǎng)代謝過程和各種物質的交換［8］.骨支架材料應與骨組織內部結構相似，其孔徑介于200~400 μm之間，接近機體骨單元大?。?7］.本文合成的5組支架材料孔隙率介于60%～75%之間，均具有相似的疏松多孔結構，其縱斷面在掃描電子顯微鏡下均呈現(xiàn)出比較均勻的片層狀，孔徑大小可達180 μm以上且高度連通.

實驗采用的殼聚糖、海藻酸鈉與納米硅酸鎂鋰3種原材料均具有良好的生物活性.傅里葉變換紅外光譜顯示，在合成殼聚糖-海藻酸鈉-納米硅酸鎂鋰新型復合骨支架材料的整個過程中并未發(fā)生化學反應，不僅無新物質生成，也不會產生有毒的降解產物.細胞細胞毒性實驗結果顯示，各組材料細胞相對增值率為0級或1級，表明此種新型復合骨支架材料具有良好的生物相容性.復合支架材料中的硅酸鎂鋰發(fā)生溶脹，使鎂離子和鋰離子析出，從而促進細胞增殖活性的提高［18］.

制備的新型支架均具有良好的親水性，在0.5 h內吸水溶脹率顯著上升，在1~48 h范圍內，溶脹曲線逐漸趨于平穩(wěn).其中硅酸鎂鋰的添加量會直接影響支架材料的溶脹率，當所用nLSM溶液的濃度由1%增加到3%時，所得nLMS-CS-SA復合支架材料的溶脹率逐漸下降，3%nLMS-CS-SA的溶脹率最低.這是由于nLSM具有良好的親水性，當支架中nLSM比例較少時，可以增加支架的親水能力，最終表現(xiàn)為溶脹率的增加.但當支架中nLSM含量逐漸增加時，其質量因素比親水因素對支架的吸水溶脹率影響更大，表現(xiàn)為支架的吸水溶脹率逐漸減小.但當所用nLMS溶液的濃度為4%時，所得復合支架材料的溶脹率又轉而增大，這是由于復合體系原本維持一種均勻分散的狀態(tài)，當nLSM濃度進一步增加時會打破這種臨界平衡.復合體系難以在電荷作用下均勻分散，從而出現(xiàn)局部的聚集、沉淀，造成局部結構的塌陷和斷裂，導致材料內部孔隙不均勻增大，允許更多的水分子的進入.

骨支架材料應具有一定的降解速率，具有可被宿主酶和其它生物過程降解的特性.但降解速率不能過快或過慢，應在保證其足夠骨支撐強度的同時又能允許組織細胞向內部逐漸生長.隨著時間推移，降解的支架結構被新生組織替代，以維持局部空間結構的穩(wěn)定.本文制備的各組支架材料均具有良好的降解性，其中3%nLMS-CS-SA組復合支架材料降解最慢.這可能是由于高濃度的nLSM使分子間作用力增強，抑制了nLMS-CS-SA復合支架材料中的聚合物分子向溶劑體系中擴散.雖然加入nLSM后的nLMS-CS-SA復合支架材料的降解速率相比對照組有所減慢，但仍短于一些學者提出的6個月的降解時間［19］.這可能是本文工作是在體外模擬環(huán)境下進行，忽略了生物體內多種酶消化作用和吞噬細胞等的分解作用.

骨支架材料應具有一定的骨傳導性和骨誘導性，單一的骨支架材料骨形成活性較低，因此人們通過在骨支架材料上負載生長因子或包載某些生物信號來促進干細胞的增殖、黏附和成骨分化.本文用到的殼聚糖可促進細胞的黏附，其原理是利用側鏈上的氨基基團與細胞膜相關蛋白結合［20］.微血管結構的形成亦可影響骨支架材料的骨修復能力，硅酸鎂鋰通過促進人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）的黏附和遷移來發(fā)揮促成血管活性，并為新生的組織結構提供營養(yǎng)支持［21］.此外，硅酸鎂鋰在體內和體外的降解產物Mg2+，Si（OH）4和Li+可上調成骨相關基因的表達，并促進Ⅰ型膠原合成，從而發(fā)揮 成 骨誘導活性.

3 結論

通過溶液-凝膠法和冷凍干燥技術合成了nLMS-CS-SA復合支架材料，其合成過程容易，操作簡單，產物形態(tài)可塑，凍干后大小、形狀與所在容器一致.由于患者骨缺損處大小形態(tài)不一，因此具有良好可塑性及疏松多孔三維網絡狀結構的nLMS-CS-SA復合支架材料有望應用于骨缺損修復的個性化設計.摻入nLMS的nLMS-CS-SA復合支架材料孔隙率下降，但在親水溶脹性和穩(wěn)定性方面更具優(yōu)勢，且無細胞毒性，體外降解時間延長，并具有良好的細胞相容性.