閆旭宇，李娟，李玲

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000)

黃秋葵(AbelmoschusesculentusL.)屬于錦葵科秋葵屬一年生草本植物，又名秋葵、補(bǔ)腎草，在我國(guó)大部分地區(qū)均有種植。黃秋葵作為藥食兩用植物，以嫩果供食用，富含黃酮、多糖、果膠、微量元素、氨基酸等功效成分，具有保肝強(qiáng)腎、降低血糖、清火明目、健胃潤(rùn)腸、幫助消化、抗疲勞、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力等功能，在食品及調(diào)味品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1-2]。

黃酮類化合物是一種天然的有效活性成分，在食品加工中廣泛用于各種調(diào)味食品和保健食品的生產(chǎn)[3]，具有抗氧化、消炎抑菌、抗腫瘤、降血糖、提高機(jī)體免疫力等多種生物活性[4-6]。黃酮類化合物大多含有羥基、甲氧基和異戊烯基等，易溶解于極性較大的有機(jī)溶劑。因此，利用乙醇等無毒且易回收的有機(jī)溶劑提取黃酮是常用的提取方法之一，而微波、超聲波、加酶等輔助手段有利于提高有機(jī)溶劑的提取效率，尤其是超聲波操作簡(jiǎn)單、容易控制，通過物理方法破壞植物的細(xì)胞壁，不易造成化學(xué)污染，縮短提取時(shí)間，提高活性成分溶解率和得率[7-8]。同時(shí)，黃酮類化合物特有的結(jié)構(gòu)決定了其捕獲活性氧等自由基的能力較強(qiáng)，可作為一種天然、安全、有效的抗氧化劑，減輕過量自由基對(duì)機(jī)體的損害，進(jìn)而降低心血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病及并發(fā)癥的發(fā)生[9]。因此，在考慮成本的情況下，采用超聲輔助乙醇提取黃秋葵嫩果黃酮，有助于提高黃酮得率。

黃秋葵作為藥食兩用植物，因其良好的功能和保健作用而愈發(fā)受到人們的喜愛，其種植推廣面積逐年增長(zhǎng)[10]。因此，深度加工與開發(fā)黃秋葵對(duì)提高其附加值及資源的利用率具有重要意義。本研究以黃秋葵嫩果為材料，以黃酮得率為指標(biāo)，利用超聲輔助乙醇提取黃秋葵嫩果黃酮，用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化黃秋葵嫩果黃酮的提取工藝條件，并初步研究黃酮對(duì)羥自由基的清除作用，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用黃秋葵資源提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

黃秋葵嫩果：產(chǎn)自陜西延安。

無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、抗壞血酸等試劑(均為國(guó)產(chǎn)分析純)：陜西和平化玻有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%)：上海一基生物試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FW-100D型植物粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)、AUX220型分析天平 日本島津公司；WG-71型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ500B型超聲波清洗儀 昆山超聲儀器有限公司；SHZ-D Ⅲ型循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃秋葵嫩果黃酮的提取工藝流程

黃秋葵嫩果→清洗→去?！衅?0 ℃烘干至恒重→粉碎→過篩(60目)→黃秋葵干粉→超聲輔助乙醇回流提取(250 W)→提取2次合并粗提液→室溫減壓抽濾→濾液旋蒸→定容→提取液。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及黃秋葵嫩果黃酮得率的計(jì)算

參照閆旭宇等的方法繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在已配制好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，依次加入Na(NO2)、Al(NO3)3、NaOH溶液，發(fā)生顯色反應(yīng)。以不加蘆丁對(duì)照品溶液為參比，在510 nm處測(cè)吸光度，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=1.425x+0.0028，R2=0.9965。

采用Na(NO2)-Al(NO3)3-NaOH法測(cè)定總黃酮[11]。根據(jù)回歸方程計(jì)算出提取液中黃酮的質(zhì)量濃度，再按照公式(1)計(jì)算黃秋葵嫩果黃酮的得率(%)：

(1)

式中：Y為黃酮得率，%；C為提取液中黃酮濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為稱量的黃秋葵嫩果粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 乙醇濃度對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響

稱取5.0 g干燥的黃秋葵嫩果粉末5份，分別加入料液比為1∶30(g/mL)的濃度為55%、60%、65%、70%、75%的乙醇，在60 ℃的條件下超聲30 min，研究乙醇濃度對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響。

1.2.3.2 料液比對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響

稱取5.0 g干燥的黃秋葵嫩果粉末5份，分別加入料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40(g/mL)的濃度為65%的乙醇，在60 ℃的條件下超聲30 min，研究料液比對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響

稱取5.0 g干燥的黃秋葵嫩果粉末5份，分別加入料液比為1∶30(g/mL)的濃度為65%的乙醇，分別在50，55，60，65，70 ℃的條件下超聲30 min，研究提取溫度對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響。

1.2.3.4 超聲時(shí)間對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響

稱取5.0 g干燥的黃秋葵嫩果粉末5份，分別加入料液比為1∶30(g/mL)的濃度為65%的乙醇，在60 ℃的條件下超聲20，25，30，35，40 min，研究超聲時(shí)間對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以黃酮得率為響應(yīng)值，對(duì)影響黃秋葵嫩果黃酮得率的乙醇濃度、料液比、提取溫度和超聲時(shí)間4個(gè)因素的3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定超聲波輔助提取黃秋葵嫩果黃酮的最佳工藝條件。各因素的水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.2.5 黃秋葵嫩果黃酮清除羥自由基試驗(yàn)

黃秋葵嫩果黃酮及Vc對(duì)羥基自由基(·OH)的清除率采用水楊酸法進(jìn)行測(cè)定。其中，黃酮濃度(mg/mL)以黃酮含量計(jì)算?！H的清除率計(jì)算公式如下：

(2)

式中：E為·OH的清除率(%)；A0為空白對(duì)照液的吸光值；Am為加入黃酮后的吸光值；An為不加H2O2時(shí)黃酮的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用響應(yīng)面分析軟件Design Expert V8.0.6.1的Box-Behnken Design進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析，采用 Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，隨著乙醇濃度的提高，黃秋葵嫩果黃酮得率逐漸增加，在65%時(shí)達(dá)到最高，之后黃酮得率逐漸降低。較高的乙醇濃度會(huì)增加其他可溶性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、兒茶素等的溶出量，降低黃酮相對(duì)含量[12]。黃秋葵嫩果黃酮得率隨著提取液體積的增加而增加，料液比為1∶30(g/mL)時(shí)的得率略低于1∶35(g/mL)和1∶40(g/mL)時(shí)的得率，但考慮到成本，料液比的適宜取值為1∶30(g/mL)。隨著提取溫度由50 ℃上升到60 ℃，黃秋葵嫩果黃酮得率直線上升，在60 ℃時(shí)得率最大，高于60 ℃時(shí)得率明顯下降。溫度較低時(shí)黃酮溶出較慢，但溫度較高時(shí)會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)溶出增多，且影響黃酮的穩(wěn)定性[13]。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黃秋葵嫩果黃酮得率先升后降，在30 min時(shí)達(dá)到最大值，之后黃酮得率明顯下降。超聲提取時(shí)間過長(zhǎng)不僅增加能耗，而且消耗溶劑并影響黃酮的穩(wěn)定性和相對(duì)含量[14]。因此，考慮到提取成本和黃酮的相對(duì)穩(wěn)定性，選擇4個(gè)因素的3個(gè)較適宜水平，即乙醇濃度(60%、65%、70%)、料液比(1∶25、1∶30、1∶35，g/mL)、提取溫度(55，60，65 ℃)、超聲時(shí)間(25，30，35 min)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

圖1 乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲時(shí)間不同水平下的黃酮得率Fig.1 The yield of flavonoids under different ethanol concentration, solid-liquid ratios, extraction temperatures and ultrasonic time

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

黃秋葵嫩果黃酮提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。在響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元擬合回歸分析，得到黃秋葵嫩果黃酮得率對(duì)乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)和超聲時(shí)間(D)的四元二次回歸模型方程：

Y=4.60+0.13A+0.15B+0.068C+0.074D+0.12AB+0.035AC+0.032AD-0.038BC+0.012BD-0.13CD-0.33A2-0.25B2-0.28C2-0.2D2。

表2 黃秋葵嫩果黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results of flavonoids extracted from tender okra fruit

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

續(xù) 表

方程的決定系數(shù)R2=0.9738，說明有97.38%的響應(yīng)值變化來源于4個(gè)試驗(yàn)因素，回歸模型方程擬合度良好，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)性較好，試驗(yàn)誤差較小，說明此方程較準(zhǔn)確可靠，可很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系并預(yù)測(cè)黃秋葵嫩果黃酮的最優(yōu)提取條件[15]。

由表3回歸模型方差分析結(jié)果可知，模型的P<0.0001，極顯著，說明該模型有意義；失擬項(xiàng)的P>0.05，不顯著，說明模型與試驗(yàn)的差異值較小，可以作為預(yù)測(cè)黃秋葵嫩果黃酮最優(yōu)提取工藝參數(shù)的模型?；貧w模型方差分析中一次項(xiàng)的PA、PB、PC、PD、PAB、PCD、PA2、PB2、PC2、PD2值均小于0.01，說明4個(gè)因素的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)、乙醇濃度和料液比以及提取溫度和超聲時(shí)間的交互項(xiàng)均存在顯著性，而因素間的交互項(xiàng)及失擬項(xiàng)顯著性相對(duì)較差。表明4個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值黃酮得率均存在顯著影響，其關(guān)系是一種非線性關(guān)系[16]。由方程一次項(xiàng)及F值可知，影響黃秋葵嫩果黃酮得率的因素順序?yàn)椋毫弦罕?乙醇濃度>超聲時(shí)間>提取溫度。

2.2.2 響應(yīng)面因素間交互作用分析

由表3方差分析可知，乙醇濃度和料液比以及提取溫度和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。為更直觀形象地說明其交互影響作用，利用Design Expert 8.0.6軟件做出交互項(xiàng)的等高線圖和響應(yīng)曲面圖，見圖2。

圖2 乙醇濃度和料液比、提取溫度和超聲時(shí)間對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的交互影響Fig.2 Effect of interaction of ethanol concentration and solid-liquid ratio, extraction temperature and ultrasonic time on yield of flavonoids from tender okra fruit

由圖2可知，乙醇濃度和料液比相互作用的響應(yīng)面曲面坡度較陡峭，等高線呈扁平橢圓狀，說明乙醇濃度和料液比之間的相互作用對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響顯著；提取溫度和超聲時(shí)間相互作用的響應(yīng)面亦較陡峭，等高線基本呈扁平橢圓狀，表明提取溫度和超聲時(shí)間的相互作用較強(qiáng)，對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的影響亦顯著，但相對(duì)次于乙醇濃度和料液比之間相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c提取條件驗(yàn)證

用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)一步分析回歸方程，得出黃秋葵嫩果黃酮提取的最適條件為：乙醇濃度65.28%、料液比1∶30.36(g/mL)、提取溫度60.07 ℃、超聲時(shí)間30.2 min，預(yù)測(cè)得率為4.652%。考慮到實(shí)際操作的局限性，提取工藝最終修正為：乙醇濃度66%、料液比1∶31(g/mL)、提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間31 min。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，重復(fù)試驗(yàn)3次，黃秋葵嫩果黃酮實(shí)際得率為4.71%，與預(yù)測(cè)值(4.652%)接近，其相對(duì)誤差為1.25%，表明由Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得的黃秋葵嫩果黃酮的最佳提取工藝條件準(zhǔn)確可靠。本試驗(yàn)中超聲輔助乙醇提取黃秋葵嫩果黃酮得率高于正交試驗(yàn)優(yōu)化乙醇提取的黃酮得率3.30%[17]，以及高于微波輔助提取的黃酮得率2.78%[18]，這說明與單純的乙醇提取法相比，適宜的超聲提取功率有助于黃秋葵嫩果黃酮的最大溶出，且提取效果好于微波輔助提取。但在相同的提取方法下，本試驗(yàn)的得率略低于李加興等的得率4.85%[19]，這可能與提取條件不同以及選取材料的不同有關(guān)。

2.3 黃秋葵嫩果黃酮對(duì)羥自由基的清除作用

生物類黃酮具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力，研制經(jīng)濟(jì)有效的天然黃酮類抗氧化劑替代食品中常用的人工合成抗氧化劑是防治羥基自由基誘發(fā)疾病的重要途徑[20]。

由圖3可知，黃秋葵嫩果黃酮對(duì)·OH的清除率隨著黃酮濃度的增加而逐漸增加，清除·OH能力與濃度存在一定的量效關(guān)系。在相同濃度下，黃秋葵嫩果黃酮對(duì)·OH的清除率高于Vc，說明黃秋葵嫩果黃酮具有一定的抗氧化能力。

圖3 黃秋葵嫩果黃酮對(duì)羥自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging ability of flavonoids extracted from tender okra fruit

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出影響超聲輔助乙醇提取黃秋葵嫩果黃酮的因素依次為：料液比>乙醇濃度>超聲時(shí)間>提取溫度，乙醇濃度和料液比以及提取溫度和超聲時(shí)間對(duì)黃秋葵嫩果黃酮得率的交互影響較強(qiáng)。優(yōu)化得出的黃秋葵嫩果黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度66%、料液比1∶31(g/mL)、提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間31 min，在此條件下，黃秋葵嫩果黃酮得率為4.71%。通過對(duì)羥自由基的清除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相同質(zhì)量濃度下，黃秋葵嫩果黃酮提取物對(duì)羥自由基的清除效果高于Vc，表明黃秋葵嫩果黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可以作為一種羥基自由基的天然清除劑進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用。本研究結(jié)果為黃秋葵嫩果黃酮的規(guī)?；崛『烷_發(fā)應(yīng)用提供了理論參考。