徐菁，劉曉燕,2*，郭銀萍，穆興燕

(1.貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴陽 550005；2.貴州省果品加工技術(shù)研究中心，貴陽 550005)

小黃姜(GlobbaracemosaSmith)，姜科姜屬植物，其切面純黃色，味辛辣濃，肉細(xì)嫩，味香，纖維較細(xì)[1]，具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖和心血管保護(hù)活性[2]，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物。生姜中含有的有效成分很多，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，目前已鑒定出來的成分已經(jīng)達(dá)到100多種，主要可以分為揮發(fā)油、姜酚和二苯基三大類[3]。姜的辛辣味道歸因于姜酚(GNS)的存在，GNS是一組揮發(fā)性酚類化合物，對(duì)人體健康和營(yíng)養(yǎng)有重要貢獻(xiàn)[4-5]，具有多種生物活性，從抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎、抗過敏到各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性[6]。

姜酚的提取主要采用傳統(tǒng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的方法，如超臨界CO2萃取法、微波提取法、溶劑提取法等，提取過程中會(huì)產(chǎn)生大量的污染物，有機(jī)溶劑浪費(fèi)。鑒于此，尋找更高效、更節(jié)能的提取方法迫在眉睫，生物酶解提取法是一種較新的方法，生物酶解提取法是指在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上，采用酶類酶解細(xì)胞壁及間質(zhì)中的纖維素等物質(zhì)[7]，其中纖維素酶能高效地對(duì)植物細(xì)胞壁組分進(jìn)行酶解，促進(jìn)細(xì)胞壁內(nèi)有效成分的釋放[8]。超聲波提取法主要利用超聲波的空化、機(jī)械和熱效應(yīng)加速有效成分的溶出[9-10]，二者相輔相成的促進(jìn)作用顯著提高了提取效率，鑒于此，本課題采用纖維素酶與超聲結(jié)合法提取小黃姜中的姜酚，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化小黃姜姜酚的提取條件，并進(jìn)行抗氧化活性研究，姜酚是生姜中的主要活性成分，所以本文旨在為姜酚有效成分的提取提供新途徑，為姜酚深加工技術(shù)的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

小黃姜：購(gòu)自貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣黔棠姜生物科技有限公司。經(jīng)清洗、切片、液氮速凍，小型粉碎機(jī)粉碎，裝盤，放入真空冷凍干燥機(jī)中凍干，凍干條件0.1 kPa，凍干時(shí)間18 h，凍干粉取出后用自封袋裝好放置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

纖維素酶(綠色木霉，50 U/mg，Lot：H31A11S122948)：上海源葉生物科技有限公司；香蘭素(香草醛，分析純AR)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸-水、檸檬酸鈉：大自然生物集團(tuán)有限公司；乙醇(100%，分析純AR)：天津康耐珂德科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 主要儀器

CS-2001-02粉碎機(jī) 永康市天棋盛世工貿(mào)有限公司；BILKON-FD5BD真空冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；FAB1243分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；TDZ5-WS高速離心機(jī) 湖南平凡科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小黃姜中姜酚的提取工藝

小黃姜→清洗→液氮速凍→粉碎→冷凍干燥→纖維素酶處理→超聲處理→離心→測(cè)定。

1.2.2 香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取香草醛標(biāo)準(zhǔn)品0.5 g，移入100 mL容量瓶中用無水乙醇定容、搖勻，再精確吸取5 mL，移入100 mL容量瓶中用無水乙醇定容，得0.25 mg/mL香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.2.3 測(cè)定條件的選擇

姜酚目前沒有固定標(biāo)品，因香草醛與姜酚的母核結(jié)構(gòu)相似，故本文選用香草醛作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)[11]。以無水乙醇作為空白對(duì)照，將香草醛的無水乙醇溶液及姜酚的無水乙醇提取液進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，掃描波長(zhǎng)范圍在200～400 nm，紫外吸收曲線見圖1。由紫外吸收曲線可知，香草醛和小黃姜的乙醇粗提液都在280 nm處有顯著的吸收波長(zhǎng)。

圖1 無水乙醇姜酚粗提液(a)和無水乙醇香草醛溶液(b)Fig.1 The anhydrous ethanol gingerol crude extract (a) and anhydrous ethanol vanillin solution (b)

1.2.4 香草醛標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

參考劉軍偉等[12]的方法，稍作調(diào)整。配制質(zhì)量濃度為250 μg/mL的香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確吸取香草醛標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中[13]，用無水乙醇定容到刻度線，渦旋混合均勻?？瞻讓?duì)照為乙醇(100%)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，測(cè)定其吸光度值。

由圖2可知，y軸表示測(cè)定的吸光度值A(chǔ)，x軸表示濃度(μg/mL)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.0624x-0.1266，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，線性關(guān)系良好。

圖2 香草醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of vanillin

1.2.5 姜酚的提取

精確稱取小黃姜冷凍干燥粉1 g，按照料液比1∶20(g/mL)加入20 mL pH 5的緩沖溶液，添加0.04 g纖維素酶，在水浴鍋溫度50 ℃下酶解1 h后，96 ℃滅酶3.5 min。加入20 mL無水乙醇，在200 W超聲功率下超聲30 min，在轉(zhuǎn)速2500 r/min下離心10 min后取上清液1 mL定容至10 mL，在280 nm處測(cè)其吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)的含量：

姜酚=(2.001V0V1C)/(V2W×106)×100%。

式中：2.001為香草醛換算成姜酚的系數(shù)；V0為樣品提取液總體積(mL)；V1為測(cè)定樣液總體積(mL)；C為香草醛濃度(μg/mL，回歸方程中求出)；V2為測(cè)定的樣品溶液體積(mL)；W為稱取的樣品量(g)。

1.2.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6.1 料液比的選擇

在固定條件：超聲功率、時(shí)間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，酶添加量0.03 g、pH 5、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間60 min下，考察其料液比為1∶0、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL )時(shí)對(duì)姜酚提取率的影響。

1.2.6.2 酶添加量的選擇

在固定條件：超聲功率、時(shí)間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間60 min下，考察酶添加量分別為0.01，0.03，0.05，0.07，0.09 g時(shí)對(duì)姜酚提取率的影響。

1.2.6.3 酶解溫度的選擇

在固定條件：超聲功率、時(shí)間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.05 g、酶解時(shí)間60 min下，以30，40，50，60，70 ℃作為酶解溫度考察指標(biāo)，探究不同酶解溫度對(duì)姜酚提取率的影響。

1.2.6.4 酶解時(shí)間的選擇

在固定條件：超聲功率、時(shí)間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.05 g，酶解溫度50 ℃下，以20，40，60，80，100 min作為酶解時(shí)間考察指標(biāo)，探究不同酶解時(shí)間對(duì)姜酚提取率的影響。

1.2.6.5 pH的選擇

在固定條件：超聲功率、時(shí)間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、酶添加量0.05 g、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間40 min，以3，4，5，6，7作為pH考察指標(biāo)，探究不同pH對(duì)姜酚提取率的影響。

1.2.6.6 超聲時(shí)間

在固定條件：超聲功率、溫度分別為250 W、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.03 g、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間40 min，以10，20，30，40，50 min作為超聲時(shí)間考察指標(biāo)，探究不同超聲時(shí)間對(duì)姜酚提取率的影響。

1.2.6.7 超聲溫度

在固定條件：超聲功率、時(shí)間分別為250 W、30 min，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.05 g、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間40 min，以20，30，40，50，60 ℃作為超聲溫度考察指標(biāo)，探究不同超聲溫度對(duì)姜酚提取率的影響。

1.2.7 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)

P-B簡(jiǎn)稱爬坡試驗(yàn)，是從多個(gè)單因素中篩選出對(duì)試驗(yàn)影響最大的單因素的方法[14]。主要是對(duì)單因素中每個(gè)因子取(+1)和(-1)兩水平進(jìn)行分析，通過比較各個(gè)因子(+1)和(-1)的差異與整體的差異來確定因子的顯著性。通過 P-B試驗(yàn)對(duì)7個(gè)單因素的篩選，能夠減少在后面的優(yōu)化試驗(yàn)中由于因素太多或部分因子不顯著而耽誤試驗(yàn)進(jìn)度和影響試驗(yàn)結(jié)果[15]。

本試驗(yàn)采用N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響小黃姜姜酚提取率的7個(gè)因素料液比(A)、酶添加量(B)、酶解溫度(C)、酶解時(shí)間(D)、pH(E)、超聲時(shí)間(F)、超聲溫度(G)進(jìn)行篩選。每個(gè)因素取高(+1) 、低(-1)兩個(gè)水平，以提取率作為響應(yīng)值(Y)，其取值見表1。

表1 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平取值Table 1 The factors and levels of P-B test design

1.2.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素和P-B試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響小黃姜姜酚提取率的4個(gè)顯著影響因素: pH(E)、料液比(A)、酶解溫度(C)和超聲溫度(G)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，以此確定最佳提取條件。正交試驗(yàn)因素與水平表見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 The factors and levels of orthogonal test

1.2.9 姜酚粗提物抗氧化活性研究

1.2.9.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考巫永華等[16]的方法，稍作改動(dòng)，用乙醇(100%)配制DPPH乙醇溶液1 mmol/L，用乙醇(100%)分別配制姜酚粗提液(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL)。分別取2.0 mL姜酚粗提液、DPPH自由基溶液(1.2 mmol/L)渦旋35 s，混合均勻，暗處放置 30 min，以乙醇(100%)作參照，測(cè)定吸光值 A；2.0 mL 粗提液、95%乙醇混合后測(cè)定的吸光值為A0；2.0 mL乙醇(100%)+2 mL DPPH溶液混合后測(cè)定的吸光值為A1。以上吸光度均在517 nm處測(cè)定，以同濃度的Vc作陰性對(duì)照，清除率計(jì)算公式為：

清除率=[1-(A-A0)/A1]×100%。

1.2.9.2 ABTS 自由基清除能力的測(cè)定

參照艾薇等[17]的方法,稍作改動(dòng)，取ABTS 自由基溶液(6.6 mmol/L)和K2S2O8溶液(3.2 mmol/L)等體積混勻，避光放置17～22 h，將ABTS 自由基溶液用乙醇(100%)進(jìn)行稀釋，直至吸光度為0.70±0.02。取 0.2 mL樣品液+3.8 mL ABTS自由基溶液，在波長(zhǎng)為734 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)，同時(shí)將0.2 mL乙醇(100%)+3.8 mL ABTS溶液混合后測(cè)定其吸光值 A1，以及樣品溶液+乙醇(100%)混合后的吸光值A(chǔ)0，以同濃度的Vc作陰性對(duì)照，清除率計(jì)算公式為：

清除率=[1-(A-A0)/A1]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖3中(1)可知，在料液比1∶10～1∶50 (g/mL)范圍內(nèi)，當(dāng)溶劑在10～20 mL時(shí)提取率隨著料液比的升高而升高，當(dāng)溶劑在20～30 mL時(shí)提取率下降幅度較大，之后隨著溶劑的增加提取率逐漸降低，這是由于溶劑占比增加導(dǎo)致酶的濃度降低，從而降低了酶與底物的接觸概率；同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)的溶出[18]，從而降低了小黃姜姜酚提取率，因此料液比選擇1∶20(g/mL)最適宜。

圖3 單因素對(duì)小黃姜姜酚提取率的影響Fig.3 The single factor on the extraction rate of gingerol from Globba racemosa Smith

由圖3中(2)可知，在酶添加量0.01～0.09 g范圍內(nèi)，酶添加量在0.01～0.05 g時(shí)提取率隨著添加量的增加而升高，0.05 g時(shí)達(dá)到最大提取率，之后提取率逐漸下降，再增加酶添加量對(duì)提取率影響不大。這是因?yàn)殡S著酶添加量的增加，反應(yīng)逐漸趨于完全，當(dāng)達(dá)到最大添加量時(shí)，沒有足夠底物與之接觸，導(dǎo)致酶的作用受到抑制[19]，因此酶的添加量定為0.05 g最恰當(dāng)。

由圖3中(3)可知，在酶解溫度30～70 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，姜酚提取率也逐漸升高，溫度升高到50 ℃時(shí)姜酚提取率達(dá)到最大值，隨后姜酚提取率大幅度下降，再提高酶解溫度對(duì)提取率影響不大，這是由于酶作用有其最適溫度，超過最適溫度后，隨著溫度的升高，酶活性會(huì)降低[20]，因此酶解溫度定為50 ℃最恰當(dāng)。

由圖3中(4)可知，在酶解時(shí)間20～100 min范圍內(nèi)，20～40 min姜酚提取率大幅度上升，40 min以后提取率逐漸下降，這是因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，溶出雜質(zhì)逐漸增多，導(dǎo)致提取率下降，因此酶解時(shí)間定為40 min最合適。

由圖3中(5)可知，當(dāng)pH達(dá)到5時(shí)提取率達(dá)到最大值，之后再增加pH對(duì)提取率的影響不大，酶在最適pH范圍內(nèi)酶活力比較大，能最大程度發(fā)揮其作用，超過此范圍酶會(huì)失活，因此pH 5時(shí)最恰當(dāng)。

由圖3中(6)可知，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)提取率達(dá)到最大值[21]，之后隨著超聲時(shí)間的增加，對(duì)提取率的影響不大，超聲具有較強(qiáng)的機(jī)械效應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)有利于姜酚的溶出，長(zhǎng)時(shí)間的作用會(huì)破壞姜酚而使姜酚有損失，因此超聲時(shí)間為30 min時(shí)最恰當(dāng)。

由圖3中(7)可知，隨著超聲溫度的增大，提取率逐漸升高，溫度升高到40 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大值，隨后隨著溫度的增大，提取率大幅度下降。姜酚由于含量較少，穩(wěn)定性較差，容易受到高溫影響而導(dǎo)致含量減少，因此超聲溫度為40 ℃時(shí)最恰當(dāng)。

2.2 P-B試驗(yàn)

P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表 3，通過對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

表3 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 P-B test design and corresponding results

續(xù) 表

表4 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis results of P-B test design

由表4可知各因素是否有統(tǒng)計(jì)意義，T檢驗(yàn)顯示：因素G回歸系數(shù)不為0的假設(shè)成立，T=3.21，P=0.033<0.05，有統(tǒng)計(jì)意義。同理因素A，C，E有統(tǒng)計(jì)意義，可以認(rèn)為pH(E)、料液比(A)、酶解溫度(C)和超聲溫度(G)這4個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著影響，由圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖從上到下順序?qū)?yīng)A～G 7個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果Y的重要程度，標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)超過豎線(>2.78)對(duì)應(yīng)的因素是顯著影響因素。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖Fig.4 The Pareto diagram of standardized effect

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，以小黃姜姜酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，選擇A，C，E，G 4個(gè)因素，確定最佳提取條件的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析(見表5)，方差分析結(jié)果見表6。

表5 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 The results of analysis of orthogonal test for optimization of extraction conditions

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 The variance analysis of orthogonal test results

由表5可知，由極差R的大小可知，影響提取率最大的因素是A(料液比)，其次是C(酶解溫度)，再次是E(pH)，最小的是G(超聲溫度)，其影響提取率由大到小排序?yàn)锳>C>E>G。提取小黃姜姜酚最優(yōu)的條件為A1C2E3G3，即按照料液比1∶10(g/mL)，pH 6，酶解溫度50 ℃，超聲溫度50 ℃。在此最佳提取條件下，小黃姜姜酚提取率為1.917%。

2.4 姜酚抗氧化活性研究

2.4.1 姜酚對(duì)DPPH的清除能力

由圖5可知，對(duì)照組VC和姜酚均對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出了清除能力。姜酚對(duì)DPPH的清除率隨著濃度的增加而升高，當(dāng)濃度超過0.08 mg/mL 時(shí)，清除率的上升趨勢(shì)有所減緩。VC在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率均在90%以上[22]，總體來說，超聲波-纖維素酶法輔助乙醇提取的小黃姜姜酚粗提物具有良好的清除活性。

圖5 姜酚粗提物及Vc對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.5 The effect of gingerol crude extract and Vc on scavenging rate of DPPH free radical

2.4.2 姜酚對(duì)ABTS的清除能力

由圖6可知，對(duì)照組Vc和姜酚粗提物對(duì)ABTS自由基均具有清除能力。姜酚粗提物對(duì)ABTS自由基的清除率隨著濃度的升高而變大，且各個(gè)濃度間的差異都表現(xiàn)出顯著性[23]，最大濃度的清除率達(dá)到67.44%。總體來說，超聲波-纖維素酶法輔助乙醇提取的小黃姜姜酚粗提物具有良好的清除活性。

圖6 姜酚粗提物及Vc對(duì)ABTS自由基清除率的影響Fig.6 The effect of gingerol crude extract and Vc on scavenging rate of ABTS free radical

3 結(jié)論

對(duì)小黃姜進(jìn)行了纖維素酶-超聲波輔助法提取的研究，在單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman 試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的提取條件為：料液比1∶10(g/mL)，pH 6，酶添加量0.05 g，酶解時(shí)間40 min，酶解溫度50 ℃，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度50 ℃，測(cè)得小黃姜姜酚的提取率為1.917%，超聲波輔助結(jié)合纖維素酶解提取法結(jié)合了兩種提取方法的優(yōu)點(diǎn)，利用二者相輔相成的促進(jìn)作用顯著提高了小黃姜姜酚提取率，具有提取時(shí)間短、條件溫和、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，為小黃姜中有效成分的提取提供了新途徑，在抗氧化試驗(yàn)中，隨著姜酚粗提液濃度的增加，姜酚粗提物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基的清除率始終略低于Vc，這表明姜酚粗提物對(duì)ABTS自由基具有較好的清除能力。