張海靜，楊哲，張敏，曹燕飛，姜麗君，李宏軍

(山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

醬油渣是醬油釀造過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物[1]，約含80%水分，微生物易生長繁殖，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)產(chǎn)生異味，不利于醬渣貯藏[2]。目前對(duì)醬油渣的處理方式很簡單，如簡單處理后作為飼料，但是由于鹽分高，會(huì)造成動(dòng)物適口性差，甚至引起動(dòng)物食鹽中毒[3]；如果作為肥料，會(huì)引起土壤鹽堿化；或者直接丟棄，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題[4]，同時(shí)造成大量的資源浪費(fèi)。對(duì)醬油渣的處理和利用率成為制約醬油行業(yè)發(fā)展的主要原因，這也吸引了更多學(xué)者的關(guān)注。

醬油在釀造過程中對(duì)原料中蛋白質(zhì)的利用率在60%左右[5]，部分蛋白質(zhì)依然殘留在醬油渣中。經(jīng)凱氏定氮法測定，醬油渣(干基)中含有約26%的蛋白質(zhì)。近年來，大量的學(xué)者對(duì)醬油渣中蛋白質(zhì)的性質(zhì)、多肽的提取工藝及抗氧化性[6]進(jìn)行了一系列的研究，但對(duì)醬油渣進(jìn)行擠壓來探討蛋白質(zhì)的消化率變化研究鮮有報(bào)道。蛋白消化率的高低影響到食品中蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值[7]，這是因?yàn)榈鞍酌钢苿┑拇嬖谝约暗鞍踪|(zhì)的固有結(jié)構(gòu)都會(huì)影響蛋白質(zhì)的消化率[8]。在擠壓的過程中由于高溫的存在可以使酶制劑活性降低甚至被滅活，同時(shí)也會(huì)使醬油渣中蛋白質(zhì)變性；剪切力和壓力也會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，有利于蛋白消化率的提高[9]。

因此，本研究以期可以將擠壓技術(shù)運(yùn)用到醬油渣處理上，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)探究擠壓參數(shù)對(duì)醬油渣中蛋白消化率的影響規(guī)律，期望可以充分利用醬油渣中的資源實(shí)現(xiàn)“變廢為寶”，同時(shí)促進(jìn)醬油行業(yè)健康發(fā)展和提高社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)與試劑

醬油渣(含水量84%)：山東玉兔食品有限責(zé)任公司；蛋白酶和胰酶：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

單螺桿擠壓機(jī) 山東理工大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品精深加工與貯藏實(shí)驗(yàn)室自制；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；DL-5-B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 擠壓膨化的工藝流程

曬干的醬油渣(含水量7.2%)→加水調(diào)節(jié)水分含量→擠壓膨化→冷卻→備用。

1.3.2 蛋白消化率的測定

蛋白消化率的測定參考Rathod等[10]的方法。取0.2 g樣品于50 mL離心管中，添加含1.5 mg蛋白酶的0.1 mol/L HCl 15 mL于37 ℃水浴鍋中保溫3 h，然后添加0.5 mol/L NaOH 溶液3.3 mL 和含4 mg 胰酶的0.2 mol/L 磷酸緩沖溶液(pH 8.0)7.5 mL，將混合液放置于37 ℃水浴鍋中振蕩24 h后，添加10 mL 10%的TCA 終止反應(yīng)，然后在室溫下以5000 r/min 離心20 min。用凱氏定氮法測定上清液和樣品中的氮含量。

1.3.3 擠壓膨化單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 擠壓溫度對(duì)擠出物蛋白消化率的影響

稱取曬干的醬油渣，調(diào)整擠壓溫度依次為80，90，100，110，120 ℃，固定?？字睆綖?0 mm，在含水量為34%、螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min的條件下進(jìn)行擠壓膨化，測定擠出物醬油渣中蛋白消化率的百分含量。

1.3.3.2 含水量對(duì)擠出物蛋白消化率的影響

稱取曬干的醬油渣，調(diào)整含水量依次為30%、32%、34%、36%、38%，固定?？字睆綖?0 mm，在擠壓溫度為100 ℃、螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min的條件下進(jìn)行擠壓膨化，測定擠出物醬油渣中蛋白消化率的百分含量。

1.3.3.3 螺桿轉(zhuǎn)速對(duì)擠出物蛋白消化率的影響

稱取曬干的醬油渣，調(diào)整螺桿轉(zhuǎn)速依次為80，90，100，110，120 r/min，固定?？字睆綖?0 mm，在擠壓溫度為100 ℃、含水量為34%的條件下進(jìn)行擠壓膨化，測定擠出物醬油渣中蛋白消化率的百分含量。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化擠壓參數(shù)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將擠出物蛋白消化率(Y)作為考察指標(biāo)，選擇擠壓溫度(A)、含水量(B)、螺桿轉(zhuǎn)速(C)為擠壓參數(shù)，利用Design-Expert 8.0.6軟件中的CCD進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳擠壓參數(shù)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化醬油渣擠壓參數(shù)試驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface test for the optimization of extrusion parameters in soy sauce residue

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，使用Origin Pro 9.1軟件進(jìn)行繪圖，利用Design-Expert 8.0.6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 擠壓膨化單因素試驗(yàn)

2.1.1 擠壓溫度對(duì)擠出物蛋白消化率的影響

在含水量為34%、螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min的條件下研究擠壓溫度對(duì)醬油渣蛋白消化率的影響。由圖1可知，當(dāng)擠壓溫度為100 ℃時(shí)，醬油渣中蛋白消化率達(dá)到最大值，為47.31%；隨著擠壓溫度繼續(xù)升高，醬油渣中蛋白質(zhì)的消化率反而逐漸下降。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，蛋白質(zhì)逐漸發(fā)生變性，并且剪切力逐漸增大，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露出更多基團(tuán)與酶結(jié)合，導(dǎo)致蛋白消化率逐漸上升；當(dāng)擠壓溫度過高時(shí)，蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)被破壞，分子之間發(fā)生重新組合和互相交聯(lián)的不可逆變化[11]，同時(shí)與高聚碳水化合物形成復(fù)合物[12]，并且與酶的結(jié)合位點(diǎn)減少，因而蛋白消化率逐漸降低。因此，選擇擠壓溫度為100 ℃作為響應(yīng)面中間水平。

圖1 擠壓溫度對(duì)擠出物蛋白消化率的影響Fig.1 Effect of extrusion temperature on protein digestibility of extrudate

2.1.2 含水量對(duì)擠出物蛋白消化率的影響

在擠壓溫度為100 ℃、螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min的條件下研究含水量對(duì)蛋白消化率的影響。由圖2可知，隨著水分含量逐漸增加，醬油渣擠出物的蛋白消化率表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，在含水量為34%時(shí)，蛋白消化率達(dá)到最大值，為47.12%。這是因?yàn)樵诤枯^低時(shí)，擠壓過程中機(jī)筒內(nèi)水分發(fā)生散失，導(dǎo)致物料含水率降低，潤滑程度隨之下降，阻礙了物料的流動(dòng)，導(dǎo)致膨化效果不好[13]；當(dāng)含水量過高時(shí)，機(jī)筒內(nèi)摩擦力降低，并且溫度也會(huì)降低，導(dǎo)致物料沒有得到充分的擠壓蒸煮，無法達(dá)到最佳的擠壓膨化效果，導(dǎo)致蛋白消化率表現(xiàn)出降低的趨勢。因此，選擇含水量為34%作為響應(yīng)面中間水平。

圖2 含水量對(duì)擠出物蛋白消化率的影響Fig.2 Effect of water content on protein digestibility of extrudate

2.1.3 螺桿轉(zhuǎn)速對(duì)擠出物蛋白消化率的影響

在擠壓溫度為100 ℃、含水量為34%的條件下，螺桿轉(zhuǎn)速的變化決定物料在機(jī)筒內(nèi)受到的剪切力大小以及物料在機(jī)筒內(nèi)停留的時(shí)間。由圖3可知，蛋白消化率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，當(dāng)螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，蛋白消化率達(dá)到最大值，為47.41%。這是因?yàn)樵谳^低的螺桿轉(zhuǎn)速下，物料在機(jī)筒內(nèi)的停留時(shí)間長，受到充分的剪切力和高溫作用，醬油渣中蛋白質(zhì)變性時(shí)間增加并且分子結(jié)構(gòu)受到破壞，提高了蛋白質(zhì)水解敏感位點(diǎn)的可及性，增加了與酶結(jié)合的可能性，因此蛋白消化率會(huì)表現(xiàn)為增加；當(dāng)繼續(xù)增大螺桿轉(zhuǎn)速時(shí)，物料在機(jī)筒內(nèi)的停留時(shí)間短，沒有完全從固態(tài)轉(zhuǎn)化為流體熔融狀態(tài)，物料中的蛋白質(zhì)沒有完全達(dá)到變性甚至沒有變性，無法達(dá)到最佳擠壓效果，因此蛋白消化率表現(xiàn)為降低的趨勢。故選擇螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min作為響應(yīng)面中間水平。

圖3 螺桿轉(zhuǎn)速對(duì)擠出物蛋白消化率的影響Fig.3 Effect of screw rotating speed on protein digestibility of extrudate

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

將表2中獲得的擠出物蛋白消化率試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行擬合分析，獲得二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=48.54+1.52A+0.71B-0.18C+0.088AB-1.19AC+0.51BC-1.83A2-2.54B2-1.07C2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化醬油渣擠壓參數(shù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The design and results of response surface test for the optimization of extrusion parameters in soy sauce residue

由表3可知，回歸方程模型極顯著(P<0.0001)，表明回歸方程的因變量與自變量之間的相關(guān)關(guān)系顯著。回歸方程模型P<0.0001，表明該回歸模型差異極顯著，失擬項(xiàng) P=0.3684>0.05，不顯著，說明回歸方程合理且可行；R2=0.9909，RAdj2=0.9826，說明該試驗(yàn)的結(jié)果與預(yù)測值接近，因此試驗(yàn)的可信度和精密度較高。其中因素A、B，交互項(xiàng)AC、BC，二次項(xiàng)A2、B2、C2均對(duì)結(jié)果有極顯著影響(P<0.01)，但是因素C和交互項(xiàng)AB對(duì)結(jié)果沒有顯著影響(P>0.05)。由F值可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)蛋白消化率的影響依次是A(擠壓溫度)>B(含水量)>C(螺桿轉(zhuǎn)速)。綜上所述，說明所建立的醬油渣擠出物蛋白消化率的數(shù)據(jù)與模型相吻合，可以預(yù)測分析各因素對(duì)擠出物蛋白消化率的影響。

表3 擠出物蛋白消化率的回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model for protein digestibility of extrudate

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，確定擠壓溫度、含水量和螺桿轉(zhuǎn)速對(duì)擠出物蛋白消化率的影響，響應(yīng)曲面和等高線見圖4。

圖4 擠壓溫度、含水量、螺桿轉(zhuǎn)速交互作用對(duì)擠出物蛋白消化率影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of the interaction of extrusion temperature, water content and screw speed on the protein digestibility of extrudate

由圖4中a可知，保持?jǐn)D壓溫度不變，蛋白消化率隨著含水量的增加表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢；若含水量維持一定，擠壓溫度對(duì)蛋白消化率的影響表現(xiàn)為隨著擠壓溫度增加，蛋白消化率逐漸增大，當(dāng)擠壓溫度在105 ℃左右時(shí)，蛋白消化率達(dá)到最大值，隨后蛋白消化率緩慢降低?？赡艿脑蚴窃谳^低溫度時(shí)，膨化的醬油渣中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，相態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，更容易與酶結(jié)合，并且在高溫的作用下，抗?fàn)I養(yǎng)因子減少或者消失和蛋白酶抑制劑失活程度更高，引起消化率顯著升高；當(dāng)溫度超過105 ℃時(shí)，膨化醬渣中胰蛋白酶抑制劑與蛋白質(zhì)分子相互交聯(lián)形成復(fù)合物，這種相互作用增加了交聯(lián)程度，使蛋白質(zhì)更不容易被酶解，并且其中的氨基酸與其他的羰基化合物發(fā)生反應(yīng)，造成氨基酸的損失，同時(shí)引起蛋白質(zhì)的生物學(xué)效價(jià)和消化率的降低[14]，這與Rathod等[15]的研究結(jié)果一致。由圖4中b可知，固定擠壓溫度，隨著螺桿轉(zhuǎn)速的增加，蛋白消化率先表現(xiàn)出顯著性增加，在螺桿轉(zhuǎn)速為96 r/min左右時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著螺桿轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，蛋白消化率緩慢降低?？赡艿脑蚴窃诘吐輻U轉(zhuǎn)速時(shí)，雖然剪切力和摩擦力較小，但是物料在機(jī)筒內(nèi)停留的時(shí)間增加，可以受到充分的蒸煮作用，并且可以達(dá)到熔融狀態(tài)，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，蛋白消化率增加。當(dāng)螺桿轉(zhuǎn)速高于96 r/min時(shí)，此時(shí)剪切力增大，但是物料在機(jī)筒內(nèi)停留的時(shí)間變短，蛋白質(zhì)變性程度降低，同時(shí)物料沒有完全轉(zhuǎn)化為流體熔融態(tài)，導(dǎo)致蛋白消化率表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢。由圖4中c可知，當(dāng)螺桿轉(zhuǎn)速維持不變時(shí)，含水量增加對(duì)膨化醬油渣蛋白消化率有明顯改變。隨著含水量逐漸增加，蛋白消化率先是顯著增加，當(dāng)含水量在34%左右時(shí)，蛋白消化率達(dá)到峰值，當(dāng)繼續(xù)增大含水量時(shí)，蛋白消化率則表現(xiàn)出明顯下降的趨勢?？赡艿脑蚴窃谳^低含水量時(shí)，物料之間的潤滑度降低，阻礙了物料的流動(dòng)，導(dǎo)致物料與機(jī)筒之間的摩擦力和剪切力增大，擠壓膨化效果較好，同時(shí)蛋白質(zhì)分子間的氫鍵、二硫鍵等共價(jià)鍵被破壞，有利于酶結(jié)合蛋白質(zhì)內(nèi)切點(diǎn)，提高蛋白消化率[16]；當(dāng)含水量繼續(xù)增大時(shí)，物料之間濕度增大，導(dǎo)致摩擦力和剪切力減小，物料也無法達(dá)到熔融狀態(tài)，擠壓膨化效果不好，并且一些抗?fàn)I養(yǎng)素與蛋白質(zhì)相互作用形成復(fù)合物，降低了蛋白質(zhì)溶解度，同時(shí)不易被蛋白水解攻擊[17]，導(dǎo)致蛋白消化率增加。

通過二次回歸方程進(jìn)行換算可知，擠壓膨化對(duì)醬油渣中蛋白消化率影響的最優(yōu)試驗(yàn)因素組合為：擠壓溫度105.30 ℃，含水量34.23%，螺桿轉(zhuǎn)速96.50 r/min。此時(shí)，醬油渣中蛋白消化率的理論最大值為49.02%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)實(shí)際條件及操作可行性，將擠壓工藝條件調(diào)整為：擠壓溫度105 ℃，含水量34%，螺桿轉(zhuǎn)速97 r/min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過3次平行試驗(yàn)，測得實(shí)際的擠出物蛋白消化率平均值為48.7%，與預(yù)測值49.02%接近，并且誤差<5%，因此，建立的二次回歸模型是合理可行的，能夠準(zhǔn)確預(yù)測擠壓參數(shù)與蛋白消化率之間的關(guān)系，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以得出擠壓溫度和含水量對(duì)蛋白消化率有顯著影響，以擠壓溫度、含水量和螺桿轉(zhuǎn)速為擠壓參數(shù)，建立了二次多項(xiàng)式模型，對(duì)擠壓參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并證實(shí)了該模型的可行性和可靠性。通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析，得出最佳擠壓參數(shù)為擠壓溫度105 ℃，含水量34%，螺桿轉(zhuǎn)速97 r/min，在該試驗(yàn)條件下，擠出物的蛋白消化率為48.7%，與未擠壓醬油渣相比，蛋白消化率提高了47.1%，說明擠壓技術(shù)可以使醬油渣中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起醬油渣蛋白消化率的提高，同時(shí)為醬油渣資源的利用提供了一種新方式。