陳 潤，王魯民，王亞冰，曾 姣，王 倩，王建鋼，施兆鴻，彭士明

（1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

海洋是一個極其復雜的生態(tài)系統(tǒng)，海洋中環(huán)境因子的變化會對海洋生物的生命活動產(chǎn)生影響。根據(jù)政府間氣候報告專門委員會評估報告（簡稱IPCC）預測，人類大量使用化石燃料排放出的CO2已經(jīng)導致海水pH降低，并且酸化的情況正在加?。?］。近年來，關(guān)于海洋酸化對海洋生物影響的研究受到研究人員的廣泛關(guān)注。有研究表明，海洋酸化已經(jīng)對珊瑚［2－3］、軟體動物［4］、甲殼動物［5］等鈣化生物的生命活動、魚類的早期胚胎和骨骼發(fā)育造成不利影響［6］，有些魚類的感覺器官如耳石［7］也因此受損而變得行為遲鈍［8－9］。在近海的水產(chǎn)養(yǎng)殖集中海區(qū)，由于養(yǎng)殖動物密度過大，缺氧情況時有發(fā)生。研究表明，當水環(huán)境中溶氧降低時，水生動物會出現(xiàn)行動遲緩、攝食下降等情況［10］，從而影響到水生動物的正常生命活動，嚴重時可導致死亡。因此，近年來有關(guān)低氧和酸化脅迫對水生動物生命活動影響的研究逐漸引起關(guān)注。

大黃魚（Larimichthyscrocea）隸屬于石首魚科黃魚屬，是我國重要的海洋經(jīng)濟動物，也是我國增養(yǎng)殖較為成熟的魚種。據(jù)統(tǒng)計，僅2018年我國海水養(yǎng)殖的大黃魚產(chǎn)量就達到19.8萬t［13］。福建寧德官井洋是我國野生大黃魚主要的產(chǎn)卵洄游海域之一，同時也是養(yǎng)殖大黃魚的主要產(chǎn)區(qū)［14］。近年來，隨著寧德海區(qū)內(nèi)養(yǎng)殖戶數(shù)量不斷增加和養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，其高密度和粗放式的養(yǎng)殖模式不僅對養(yǎng)殖大黃魚形成了潛在的威脅，而且對海區(qū)的生態(tài)環(huán)境也造成了嚴重的影響［15］。由于該海區(qū)養(yǎng)殖網(wǎng)箱數(shù)量多且網(wǎng)箱內(nèi)養(yǎng)殖密度過大，嚴重影響了水流交換，導致養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的殘餌、糞便等有機物逐漸沉積，無法被潮水帶走，從而增加了水體的化學需氧量，極易出現(xiàn)溶氧降低的情況［16］。

近年來，受捕撈和環(huán)境的影響，大黃魚野生種群資源已經(jīng)瀕臨枯竭［14］，低氧和海洋酸化等問題可能會對野生大黃魚的生長與繁殖產(chǎn)生負面影響，從而不利于其種群資源的恢復。因此，本實驗探究了低氧-酸化脅迫對大黃魚早期發(fā)育消化生理的影響，以期為野生大黃魚種群資源保護工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大黃魚受精卵的孵化及育苗實驗在東海水產(chǎn)研究所福建福鼎研究中心進行，實驗用大黃魚受精卵取自附近大黃魚育苗廠。大黃魚受精卵運至福鼎研究中心后，先暫放于孵化桶中，待死卵沉淀分離后，取上層活性卵備用。

1.2 實驗方法

根據(jù)已有文獻記載，大黃魚稚幼魚的窒息點溶解氧（DO）為2.27 mg·L－1，因此設(shè)定低氧試驗組DO＝3.5 mg·L－1［17］；根據(jù)資料預測，到2100年海洋酸化可能使海水pH下降0.31個單位［7］，以及結(jié)合大黃魚對pH臨界值的相關(guān)文獻報道［18］，本研究設(shè)定酸化試驗組pH＝7.3。

養(yǎng)殖實驗共設(shè)置4個組，分別為：對照組：DO＝7.0 mg·L－1，pH＝8.1；低氧組：DO＝3.5 mg·L－1，pH＝8.1；酸化組：DO＝7.0 mg·L－1，pH＝7.3；低氧-酸化組：DO＝3.5 mg·L－1，pH＝7.3。本實驗控制DO和pH的方式如下：

1）向水體中充入N2來降低水體的DO值，通過YSI ProSolo實時監(jiān)測DO值，當DO降到所需濃度后即可停止充入N2；養(yǎng)殖實驗過程中嚴格控制低氧-酸化組和低氧組的氣頭出氣量，使氣頭出氣量與水體中耗氧量相持平。

2）向水體中充入CO2來降低水體的pH值，通過YSI 10實時監(jiān)測pH值，當pH降到特定值后即可停止充入CO2。

除溶氧和pH不同外，其他參數(shù)均保持一致：水溫23.0℃，海水比重為1.022。

每個處理組設(shè)置4個重復，共16個養(yǎng)殖桶，將受精卵放入各個養(yǎng)殖桶，每桶4.0×104粒，至水環(huán)境穩(wěn)定后開始取樣（記錄為0 d），并在受精卵孵出后1 d、3 d、5 d、10 d、20 d、27 d取15尾仔稚魚放入凍存管中，經(jīng)液氮速凍后置于－80℃冰箱保存，以備后期檢實驗使用。

1.3 日常管理

實驗開始后，每隔15 min測量1次DO和pH值，對參數(shù)浮動較大的及時做出調(diào)整，當DO和pH值穩(wěn)定后改為每隔6 h測量1次。待受精卵全部孵化后，及時將沉底的死卵和死魚虹吸出，以免破壞水質(zhì)。當大黃魚發(fā)育至仔魚后可開始換水，每3 d換1次，每次換水量為養(yǎng)殖水體的1／3，換水前根據(jù)不同組別預調(diào)好與該處理組相對應的DO、pH值的水，再加入養(yǎng)殖桶中。

大黃魚受精卵孵化后第3天開口，每天將300 g新鮮牡蠣（Ostreasp.）放入料理機打碎后用200目篩絹網(wǎng)反復滌蕩過濾后，少量多次均勻潑灑于各個養(yǎng)殖桶中。第6天后開始投喂鹵蟲幼體，投喂密度約為45個·mL－1，根據(jù)養(yǎng)殖桶中的鹵蟲幼體密度每天投喂1～2次，直至養(yǎng)殖實驗結(jié)束。

1.4 檢測方法

大黃魚早期發(fā)育的淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定，具體的操作步驟參照試劑盒說明書。

1.5 統(tǒng)計分析

本次實驗所得到數(shù)據(jù)采用SPSS26.0軟件進行雙因素方差分析、Excel進行柱狀圖表繪制，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長發(fā)育結(jié)果

實驗開始時各處理組受精卵處于尾芽期與心跳期之間，10 h后全部孵化出膜。卵黃囊在出膜后4～5 d消失，其中低氧-酸化組和低氧組大黃魚仔魚卵黃囊消失時間稍晚。出膜后19 d對照組和酸化組大黃魚長成稚魚，20、21 d低氧組和低氧-酸化組大黃魚先后長成稚魚。

2.2 低氧和酸化脅迫對淀粉酶活性的影響

如圖1顯示，對照組的淀粉酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在1 d和3 d顯著升高后保持穩(wěn)定，直到20 d顯著下降。低氧-酸化組同樣呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，淀粉酶活性在1 d顯著躍升之后升高趨勢逐漸平緩，5 d達到頂峰后酶活性開始逐漸降低，下降趨勢平緩；低氧-酸化組淀粉酶活性在10 d顯著低于對照組，在27 d顯著高于對照組。低氧組淀粉酶活性在1 d顯著升高后，在3 d顯著降低，5 d顯著上升保持相對穩(wěn)定，其酶活性在10 d達到頂峰，10 d后開始逐漸下降；在3 d其酶活性顯著低于對照組，在20 d則顯著高于對照組。酸化組的淀粉酶活性同樣呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，其酶活性在1 d、3 d和10 d顯著升高并在10 d達到頂峰，15 d和20 d顯著降低；但其各個時間點淀粉酶活性與對照組相比無顯著性差異。

圖1 低氧和酸化脅迫對大黃魚早期發(fā)育階段淀粉酶活力的影響Fig.1 Effect of hypoxia and acidification on amylase activity of Larimichthys crocea in early developmental stage

低氧和酸化對大黃魚早期發(fā)育淀粉酶活性的脅迫效果如表1所示。低氧脅迫在10 d存在極顯著性差異，在20 d和27 d存在顯著性差異；酸化脅迫在各個階段脅迫效果均不顯著；低氧和酸化的雙重脅迫則在3 d出現(xiàn)顯著性差異，在5 d出現(xiàn)極顯著差異。由此可見，低氧脅迫對大黃魚早期發(fā)育過程中淀粉酶活性的影響主要發(fā)生在10 d以后，而低氧和酸化的交互作用在5 d之前較明顯。

表1 低氧和酸化脅迫對大黃魚早期發(fā)育階段淀粉酶活力影響的雙因素分析Tab.1 Two-factor analysis of effects of hypoxia and acidification on amylase activity of Larimichthys crocea in early developmental stage

2.3 低氧和酸化脅迫對胰蛋白酶活性的影響

如圖2顯示，對照組的胰蛋白酶活性總體呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，其中1～5 d無顯著變化，10 d酶活性顯著降低，15～20 d逐漸上升，27 d酶活性顯著降低。低氧-酸化組的酶活性呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，其中1 d顯著升高，5 d開始逐漸降低，10 d酶活性下降顯著，15 d達到最低值，之后保持相對穩(wěn)定；低氧-酸化組酶活性在1 d、3 d和27 d顯著高于對照組，在5 d和10 d極顯著高于對照組。低氧組的酶活性呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，1 d顯著升高達到頂峰，3 d開始酶活性逐漸降低至15 d達到最低值，10～27 d胰蛋白酶活性無顯著變化；低氧組酶活性在5 d和10 d顯著高于對照組，27 d極顯著高于對照組。酸化組的酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，1 d開始逐漸上升，3 d達到頂峰后開始下降，在10 d達到最低值，15～27 d胰蛋白酶活性無顯著變化；酸化組胰蛋白酶活性在5 d顯著高于對照組。

圖2 低氧和酸化脅迫對大黃魚早期發(fā)育階段胰蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of hypoxia and acidification on parenzyme activity ofLarimichthys crocea in early developmental stage

低氧和酸化對大黃魚早期發(fā)育胰蛋白酶活性雙重脅迫的影響如表2所示。低氧脅迫在0 d、3 d和10 d的效果顯著，在1 d、5 d和27 d的效果極顯著，可見低氧脅迫對胰蛋白酶活性的影響主要表現(xiàn)在10 d之前；酸化脅迫在1 d和5 d的效果顯著，3 d的效果極顯著，表明酸化脅迫在5 d之前對胰蛋白酶活性有影響；低氧-酸化對胰蛋白酶活性的雙重脅迫作用在27 d影響顯著。

表2 低氧和酸化脅迫對大黃魚早期發(fā)育階段胰蛋白酶活力影響的雙因素分析Tab.2 Two-factor analysis of effects of hypoxia and acidification on parenzyme activity of Larimichthys crocea in early developmental stage

2.4 低氧和酸化脅迫對脂肪酶活性的影響

低氧和酸化脅迫對脂肪酶活性的影響如圖3所示。對照組脂肪酶活性從5 d開始顯著升高并在10 d達到頂峰，15 d顯著降低，0 d、1 d、3 d、15 d、20 d和27 d酶活性無顯著性差異。低氧-酸化組的酶活性呈現(xiàn)出先降低后升高再降低再升高的變化趨勢，在3 d開始下降但不顯著，5 d且到達最低值，10 d開始上升但不顯著，15 d有所下降后開始上升；低氧-酸化組在5 d、10 d和15 d，脂肪酶活性低于對照組，15 d時差異顯著，5 d和10 d差異極顯著。低氧組的酶活性在整個實驗過程中有所波動但變化均不顯著，低氧組酶活性在5 d、10 d顯著低于對照組。

圖3 低氧和酸化脅迫對大黃魚早期發(fā)育階段脂肪酶活力的影響Fig.3 Effect of hypoxia and acidification on lipase activity of Larimichthys crocea in early developmental stage

低氧-酸化對大黃魚早期發(fā)育脂肪酶活性雙重脅迫的影響如表3所示，低氧脅迫在10 d對脂肪酶活性的作用效果顯著；酸化脅迫在5 d對脂肪酶活性的作用效果極顯著；低氧-酸化的雙重脅迫對脂肪酶活性的作用沒有顯著加劇。由此可見，低氧脅迫和酸化脅迫均在5～10 d這一時段內(nèi)導致了脂肪酶活性的降低。

表3 低氧和酸化脅迫對大黃魚早期發(fā)育階段脂肪酶活力影響的雙因素分析Tab.3 Two-factor analysis of effects of hypoxia and acidification on lipase activity of Larimichthys crocea in early developmental stage

3 討論

魚類早期消化系統(tǒng)發(fā)育具有明顯的階段性，仔稚魚階段是其中最重要的環(huán)節(jié)，不同的魚類消化系統(tǒng)發(fā)育時間也有所不同。大黃魚仔稚魚發(fā)育階段的消化生理暫未見報道，僅有席峰等［19］關(guān)于大黃魚幼魚階段發(fā)育進程中消化酶活力變化的研究，因此，本研究主要以同為石首魚科的日本黃姑魚（Nibeajaponica）仔稚魚發(fā)育階段消化酶活力變化作為參考［20］。

低氧脅迫對水生動物生理生化影響的研究較多，但針對消化生理的研究相對較少。本次實驗結(jié)果可以看出，大黃魚早期發(fā)育階段淀粉酶在實驗前5～10 d其酶活性都有顯著提高，但之后又逐漸下降，這與日本黃姑魚孵化后13 d內(nèi)消化酶活性變化規(guī)律相似［21－22］，日本黃姑魚在孵化后13 d內(nèi)淀粉酶活性先升高后降低，13 d后淀粉酶活性再升高；15 d之后大黃魚與日本黃姑魚淀粉酶活性出現(xiàn)不同的變化趨勢，原因可能是黃姑魚此后開始投喂配合飼料而大黃魚在整個實驗過程都未使用配合飼料。值得關(guān)注的是，本實驗低氧脅迫前10 d大黃魚胰蛋白酶活性相較于對照組出現(xiàn)了顯著性升高，這可能是因為魚體受到脅迫后會提高胰蛋白酶活性以獲得更多的蛋白來對抗惡劣環(huán)境，當機體對惡劣環(huán)境逐漸適應后，則不再需要額外的能量來對抗外界脅迫因子，胰蛋白酶的活性便恢復正常水平。孫敏等［21］研究認為，5 d之前由于機體還沒開口或即將開口，這階段屬于內(nèi)源性營養(yǎng)到外源性營養(yǎng)的轉(zhuǎn)化，隨著自身營養(yǎng)物質(zhì)的消耗殆盡，脂肪酶活性也逐漸降低。本實驗中，低氧-酸化組在前5 d脂肪酶活性降低，可能與惡劣環(huán)境中消耗過多內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。此外，雖然低氧-酸化組的脂肪酶活性在5～15 d降低，但在20 d時開始恢復到與對照組相同水平，表明其可能在適應惡劣環(huán)境、恢復正?；钚院蟪霈F(xiàn)補償性代謝。大黃魚的開口時間在3 d左右［12］，此時可以攝入外源性營養(yǎng)物質(zhì)，對照組在5～10 d脂肪酶活性顯著升高，而其他3個處理組受到脅迫作用影響而脂肪酶活性卻無顯著變化，可能是由于脅迫作用抑制了脂肪酶的活性，因此可以推斷低氧脅迫和酸化脅迫對大黃魚早期發(fā)育過程中脂肪酶活性有抑制作用。

國內(nèi)外酸化脅迫對魚類消化生理影響的研究較少，因此本文參考部分海洋無脊椎動物的相關(guān) 研 究。KHAN等［4］對 厚 殼 貽 貝（Mytilus coruscus）的酸化脅迫研究發(fā)現(xiàn)，酸化條件下（pH＝7.7）的厚殼貽貝淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等活性均受到顯著抑制；ZHAN等［22］發(fā)現(xiàn)在酸化條件下（pH＝7.55、7.68、7.82）蝦夷馬糞海膽（Strongylocentrotusintermedius）腸道中的脂肪酶活性也受到抑制。從本實驗結(jié)果來看，大黃魚酸化組與對照組淀粉酶活性總體上雖然沒有存在太多的顯著性差異，但酸化組各個時間點之間的變化趨勢與對照組相比波動較大。脂肪酶活性除了在5 d、10 d與對照組有顯著性差異外，總體上酸化脅迫對大黃魚早期發(fā)育階段消化酶活性的影響并不大。國內(nèi)已有的關(guān)于pH對魚類消化酶活性影響的研究，也可以從側(cè)面為本實驗做參考。有研究表明，魚類各個器官的消化酶的最適pH值有所不同而且pH值差異較大，在魚類早期的消化器官發(fā)育中，胃是最早形成的［21］，而胃消化酶的最適pH值通常是中性或弱酸性［23－24］。由此推斷，借助海水酸化的條件，魚體可以更容易達到消化酶所需的最適pH值。王曉清等［18］通過對大黃魚幼魚進行急性脅迫實驗得出，大黃魚幼魚在pH為5.2時可以生存1～8 h，可見大黃魚對pH耐受性較高。此外，據(jù)報道，大黃魚如今已經(jīng)實現(xiàn)了淡水工廠化養(yǎng)殖［25－27］，淡水的pH值通常低于正常海水，因此也可以從宏觀的角度推斷：以當前設(shè)定的海洋酸化所達到的pH值雖然不會對大黃魚正常的生命活動造成危害，但對其消化生理會造成一定的影響。

許多研究表明，多環(huán)境因子脅迫對水生生物交互作用造成更大的不良影響，比如厚殼貽貝在低氧-酸化-暖化的脅迫下消化酶活性受到的抑制效果更為顯著［4］；太平洋鱈魚（Gadusmorhua）在低氧-酸化脅迫下脂肪酸代謝發(fā)生改變、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)被破壞的效果顯著［28］。HAMILTON等［29］研究了兩種巖魚（Sebastescaurinus、S.mystinus）在低氧和酸化脅迫下（pH＝7.3、7.6、7.8；DO＝2.2、4.1、6.0 mg·L－1）對其耳石發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)酸化對耳石發(fā)育影響顯著，低氧的影響較小。而本實驗的結(jié)果表明，在本實驗所設(shè)定的低氧-酸化環(huán)境脅迫下，雙因子雙重脅迫作用僅對淀粉酶活性產(chǎn)生更嚴重的影響，而對胰蛋白酶和脂肪酶活性造成的雙重脅迫效果不顯著。本實驗出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是試驗組低氧值的設(shè)定雖然處于臨界濃度（2.27 mg·L－1）和適宜濃度（4.70～5.38 mg·L－1）［17］之間，但更接近適宜濃度，因此大黃魚在受到脅迫后消化酶活性可以逐漸恢復到正常水平。

4 小結(jié)

在本實驗條件下，低氧脅迫導致大黃魚早期發(fā)育過程中淀粉酶活性在10 d以后顯著升高，而胰蛋白酶活性顯著升高主要在10 d之前，脂肪酶活性在5～10 d顯著性降低；酸化脅迫同樣導致大黃魚早期發(fā)育過程中脂肪酶活性在5～10 d顯著性降低；低氧-酸化雙脅迫對淀粉酶、胰蛋白酶、脂肪酶活性的影響要大于單一脅迫因子（低氧、酸化）。本研究揭示了低氧、酸化和雙重脅迫下大黃魚早期發(fā)育階段消化酶活性的變化規(guī)律，為后續(xù)進一步開展低氧、酸化脅迫對魚類生長、代謝影響機制的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。