畢宜慧，張鑫宇，李 杰，孫亦如，王浩哲，付東勇，尹紹武

（南京師范大學海洋科學與工程學院，江蘇省特色水產(chǎn)育種與綠色高效養(yǎng)殖技術工程研究中心，南京 210023）

暗紋東方鲀（Takifugufasciatus）是隸屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）鲀形目（Tetraodontiformes）鲀科（Tetraodontidae）東方鲀屬的江海洄游性魚類，主要分布于太平洋西岸的中國近海區(qū)域及長江中下游地區(qū)、朝鮮半島和日本，在民間多被稱為“河豚”。其肉質(zhì)鮮嫩，具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，被譽為“魚中之王”，是長江下游重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一［1－3］。人工養(yǎng)殖的暗紋東方鲀營養(yǎng)豐富，食味極鮮，雄性的精巢更是因為無毒與美味，被民間譽為“西施乳”，帶有“西施乳”的雄魚售價接近雌魚的兩倍［4－6］。此外，野生河鲀含有的河豚毒素（TTX）是一種生物堿，通過阻斷內(nèi)向鈉電流引起生物體的中毒反應，非常致命，但低濃度時也可用作藥物治療神經(jīng)疾病，目前已被開發(fā)用于臨床使用［7］。TTX產(chǎn)量極低，價格極其昂貴，含量最高處為雌性河鲀卵巢［8］。因暗紋東方鲀雌雄個體各有特點，雄性主供食用，雌性（卵巢）主供藥用，故應根據(jù)用途不同將雌雄個體分開喂養(yǎng)，同時人工繁育時，需在人工授精前按性別設定劑量催產(chǎn)，受精后雌雄分池護理親魚?？梢?，暗紋東方鲀個體的性別區(qū)分在生產(chǎn)實踐環(huán)節(jié)尤為重要。

在魚類人工繁殖過程中，性別判定是進行性別定向控制、選育及繁殖的重要基礎［9］。除了根據(jù)魚類第一性征即精巢與卵巢的區(qū)別，也可利用魚類的第二性征（副性征）進行雌雄判別。僅有部分魚類的第二性征具有明顯的差異，例如稀有鮈鯽（Gobiocyprisrarus）的雄魚胸、腹鰭較雌魚更長且鰓蓋、胸鰭上有細小的棘狀珠星［10］；半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）等鰈形目魚類，其雌性生長速度和規(guī)格均遠遠大于雄性［11］；中華鳑鲏（Rhodeussinensis）繁殖期間雄魚體色艷麗，呈金屬藍色，而雌魚則色澤黯淡［12］。但有些魚類如鱘科［13］、鲀科［14］等，其雌雄個體間第二性征并無明顯的差異，僅憑肉眼無法鑒別，只能根據(jù)第一性征進行判別，此法需剖殺活體，造成樣本浪費，且不適用于幼齡魚和珍稀瀕危物種。因此，迫切需要開發(fā)其他性別鑒定方法。

分子標記技術已被證明是進行魚類性別特異性遺傳標記以及性別控制的有效工具［15－16］，但是存在標記定位困難、耗時久、成本高等缺點［17－19］。另外，超聲波技術在條紋鱸（Morone saxatilis）、歐 洲 大 比 目 魚（Hippoglossus hippoglossus）和大西洋鱈（Cadusmorhua）等魚類性別鑒定中也發(fā)揮了重要作用［20］，但由于其技術的局限性，在實際生產(chǎn)和野外工作中不能快速簡便區(qū)分雌雄，實用性有局限。而目前利用大量魚類樣本通過測定其形態(tài)和框架指標并篩選出特殊指標來進行性別判定則是一種較為簡單實用的方法，比如武兆文等［9］基于統(tǒng)計學方法對509尾雜交黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco）“黃優(yōu)1號”中的2齡群體和3齡群體分別進行雌雄判別，準確率分別為87.0%和84.2%；吳波等［21］依據(jù)所建立的金錢魚（Scatophagusargus）雌雄判別方程的判別準確率為85.96%；郭弘藝等［22］建立的雌雄判別方程對153尾銀色鰻（Anguilla japonica）的識別準確率達到89.3%。由此可見，此法利用統(tǒng)計學方法，無需復雜儀器和技術手段，相較于分子標記技術和超聲波技術具有快速、高效、成本低等優(yōu)點，是一種行之有效的方法。

暗紋東方鲀雌雄個體外形差異較小，且生長規(guī)律相似，不易辨別，實際生產(chǎn)中需要有豐富操作經(jīng)驗的人員通過撫摸輕壓已發(fā)育成熟個體（3～4齡）的性腺進行區(qū)分，導致區(qū)分困難，易形成技術壟斷，無經(jīng)驗的人員操作時甚至有可能對魚體內(nèi)臟造成物理損傷。目前已公開的利用引物擴增鑒定東方鲀幼魚性別的方法盡管精確度高，但是需要提取魚體的組織，不可避免地會對魚類造成物理損傷［23］。而DNA提取，引物擴增和測序過程將會耗費大量時間，不利于即時標記性別，成本也過高。面對不足1齡的個體時，從外觀和撫摸都無法判斷其雌雄，若通過解剖觀察性腺以分辨雌雄的話，會導致個體死亡，失去養(yǎng)殖和利用價值。因此，市場上亟需一種耗時短、方法簡單、成本低的東方鲀屬魚類性別鑒定方法。本研究利用暗紋東方鲀的形態(tài)指標篩選出特定指標進行性別判定，以期為今后暗紋東方鲀?nèi)斯ゐB(yǎng)殖及新品種培育過程中雌雄的判別提供參考方法和理論依據(jù)，也可為其他魚類的雌雄鑒定方法研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚均于2018年4月采自江蘇省江陰市申港三鮮養(yǎng)殖有限公司，共取實驗用魚300尾，2～3月齡左右，剔除無法辨別雌雄的個體后最終得到296尾暗紋東方鲀的有效計量性狀。其體長范圍為74.90～124.10 mm，體質(zhì)量范圍為（11.752±8.320）～（56.948±8.320）g。通過解剖觀察其性腺特征確定性別，其中雌魚158尾，雄魚138尾。

1.2 數(shù)據(jù)測量

測量全部296尾暗紋東方鲀11項計量性狀，包括全長［full length，F(xiàn)L；（118.32±10.21）mm］、體長［body length，BL；（101.44±8.23）mm］、頭長［head length，HL；（36.43±3.27）mm］、軀干長［trunk length，TL，（33.07±3.48）mm］、尾 柄 長［caudal peduncle length，CPL；（20.32±2.16）mm］、尾柄高［caudal peduncle height，CPH；（9.00±1.10）mm］、體高［body height，BH；（21.50±2.78）mm］、體寬［body width，BW；（23.76±2.74）mm］、眼徑［eye diameter，ED；（5.66±0.44）mm］、眼間距［interorbital distance，ID；（19.19±1.90）mm］、體質(zhì)量［weight，W；（33.17±8.32）g］。長度測量采用游標卡尺（±0.05 mm）（573～642 mm，±0.05 mm），質(zhì)量測量采用電子天平（JSC-T29-6，±0.001 g），各指標測量方法見圖1。肥滿度（condition factor，CF）＝體質(zhì)量（g）／體長3（cm）×100%，體質(zhì)量精確至0.01 g，體長精確至0.01 cm。

圖1 暗紋東方鲀形態(tài)測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of morphometrics of T.fasciatus

1.3 數(shù)據(jù)處理

為消除個體差異對數(shù)據(jù)的影響，將測得數(shù)據(jù)進行整理及計算各性狀間的比值，共得到11項計量性狀［全長（FL）、體長（BL）、頭長（HL）、軀干長（TL）、尾柄長（CPL）、尾柄高（CPH）、體高（BH）、體寬（BW）、眼徑（ED）、眼間距（ID）、體質(zhì)量（W）］及11項比例性狀［肥滿度（CF）、全長／體長（FL／BL）、頭長／體長（HL／BL）、軀干長／體長（TL／BL）、尾柄長／體長（CPL／BL）、尾柄高／體長（CPH／BL）、尾柄長／尾柄高（CPL／CPH）、體高／體長（BH／BL）、體寬／體長（BW／BL）、眼徑／頭長（ED／HL）、眼間 距／頭 長（ID／HL）］。利 用Excel 2019進行數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計和處理，利用SPSS 21.0軟件進行主成分分析和逐步判別分析等。

2 結果與分析

2.1 暗紋東方鲀主成分分析

為簡化暗紋東方鲀的外形特征，明確其雌雄形態(tài)特點，對暗紋東方鲀雌、雄個體的11項計量性狀和11項比例性狀進行主成分分析（表1）。KMO和巴特利特球形先行檢驗證明，296尾暗紋東方鲀KMO取樣適切性量數(shù)為0.644＞0.600，巴特利特球形檢驗顯著性P＜0.01，表明各比例性狀間存在關聯(lián)，因子降維分析結果可靠。總方差分析最終獲得4個主成分，累計貢獻率為72.31%，4個主成分及其包含的性狀和負荷量見表1。其中主成分Ⅰ的貢獻率為31.47%，包括全長（FL）、體長（BL）、頭長（HL）、軀干長（TL）、尾柄長（CPL）、尾柄高（CPH）、體高（BH）、體寬（BW）、眼間距（ID）、體質(zhì)量（W）10項計量性狀，反映了暗紋東方鲀的整體輪廓指標；主成分Ⅱ的貢獻率為18.64%，包括體高（BH）、尾柄高／體長（CPH／BL）、尾柄長／尾柄高（CPL／CPH）、體高／體長（BH／BL）、體寬／體長（BW／BL），主要反映了暗紋東方鲀的整體及尾部的渾圓程度；主成分Ⅲ貢獻率為11.32%，包括頭長／體長（HL／BL）、眼徑／頭長（ED／HL）、眼間距／頭長（ID／HL），主要反映了暗紋東方鲀的頭部特征；主成分Ⅳ貢獻率為10.89%，包括肥滿度（CF）和尾柄長／體長（CPL／BL），主要反映了暗紋東方鲀的尾部特征。

表1 4個主成分貢獻率及各個指標負荷量Tab.1 Contribution rate of four principal components and the load capacity of each index

根據(jù)主成分分析的結果，對主成分Ⅰ與主成分Ⅱ的雌雄個體主成分的得分做散點圖（圖2），從圖2中可以看出，圓形相較三角形更偏上方聚集，雌魚相較于雄魚在主成分Ⅱ的得分上更高一些。

2.2 暗紋東方鲀雌雄判別分析

對所采集的296尾暗紋東方鲀11項計量性狀及11項標準化性狀進行逐步判別分析，依據(jù)各變量對判別模型的貢獻大小逐步剔除不相關變量，最終共篩選出5個變量，分別為X1（眼徑，mm）、X2（肥滿度）、X3（頭長／體長）、X4（尾柄高／體長）、X5（體寬／體長）。這5個形態(tài)指標反映了暗紋東方鲀雌雄個體在整體輪廓上的差異，根據(jù)篩選出的5個變量所建立的典型判別模型方程為：

判別函數(shù)的顯著性檢驗顯示P＜0.01，表明判別函數(shù)達到極顯著水平。分別計算出雌雄個體的判別分數(shù)值，得到暗紋東方鲀雌雄個體的頻布圖，表明該模型可以用于區(qū)分暗紋東方鲀的性別（圖3，圖4）。

圖3 暗紋東方鲀雌性個體判別分數(shù)頻布Fig.3 Frequency distribution of discriminant score of female T.fasciatus

圖4 暗紋東方鲀雄性個體判別分數(shù)頻布Fig.4 Frequency distribution of discriminant score of male T.fasciatus

根據(jù)所建立的判別方程，對所采集的296尾暗紋東方鲀進行回判，將每尾個體的5個特征參數(shù)值帶入方程，分別計算F1和F2，如果F1＞F2，則該個體為雌性，反之則為雄性。經(jīng)驗證，該判別方程的綜合判別準確率達81.1%，其中雌性判別準確率為84.2%，雄性判別準確率為77.5%（表2）。

表2 暗紋東方鲀性別判別結果Tab.2 Discriminant results of sexual distinction of T.fasciatus

對用于建立判別函數(shù)的5個形態(tài)指標進行t檢驗，結果顯示，5個形態(tài)指標中只有尾柄高／體長和體寬／體長兩個標準化性狀在暗紋東方鲀雌雄個體間呈現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01）（表3），表明雌性個體身體較寬、尾柄較高。

表3 特征性狀的t檢驗及暗紋東方鲀雌雄形態(tài)差異Tab.3 t-test of characteristics and morphological differences between female and male T.fasciatus

3 討論

魚類在脊椎動物的演化過程中處于承上啟下的地位，是分布最廣泛、種類最豐富的脊椎動物類群，現(xiàn)存三萬多種，超過了其他脊椎動物的總和，同時魚類的性別鑒定也一直是國內(nèi)外的研究熱點［24］。魚類雌雄個體間存在生長差異的現(xiàn)象，例如鱖（Sinipercachuatsi）［25－26］、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［27］和半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）［28］等，其雌雄個體間生長速度存在明顯差異。近年來，為有效區(qū)分魚類性別，多元統(tǒng)計分析方法被廣泛應用于水產(chǎn)領域，許多學者將統(tǒng)計學中的主成分分析、聚類分析、判別分析等應用于水產(chǎn)動物雌雄個體形態(tài)差異的比較，如岳亮等［14］依據(jù)所建立的判別方程對72尾紅鰭東方鲀（Takifugurubripes）的雌雄判別準確率為81.9%；諶微等［29］對554尾大黃魚（Larimichthyscrocea）進行了主成分分析及判別分析等，其結果顯示，雌魚個體間變異較雄魚更大，其中體厚指標差異最顯著；周惠強等［30］對248尾大刺鰍（Mastacembelusarmatus）進行差異顯著性分析、主成分分析、R-聚類分析和判別分析后得出，大刺鰍雌性個體相較于雄性個體頭部和軀干部較長，眼距較寬，體高較高，其判別方程準確率為69.2%，研究結果為魚類性別鑒定提供了借鑒。

本研究通過296尾暗紋東方鲀的11項計量性狀和11項標準化性狀，采用主成分分析、逐步判別分析和t檢驗的方法，最終篩選出眼徑、肥滿度、頭長／體長、尾柄高／體長、體寬／體長5個相關變量，并建立了暗紋東方鲀雌、雄判別模型。本研究發(fā)現(xiàn)，2～3月齡的暗紋東方鲀雌雄個體差異主要集中在尾部特征和長寬比例上，雄性個體較雌性個體尾柄在比例上相對較窄，體型相對窄長。與同為東方鲀屬的紅鰭東方鲀相比，岳亮等［14］的研究表明，紅鰭東方鲀雄性特征為體形較寬、體周長較長，形成此差異的原因可能是兩者選取的養(yǎng)殖群體年齡不同。性腺的發(fā)育程度能夠影響鲀類的腹圍和體寬。岳亮等［14］選取2～3年齡的紅鰭東方鲀，其雄性個體性成熟較早，雌性個體未性成熟，因此造成雄性特征為體形較寬、體周長較長，與華元渝等［31］的研究結果契合。而本研究選取2～3月齡的暗紋東方鲀幼魚，其雌雄個體生長速度區(qū)分不明顯，性腺發(fā)育不成熟，體型差異受性腺影響較小，2～3月齡雄魚反而體型相對較窄，與岳亮等［14］的研究結果相反。因為目前并無對暗紋東方鲀幼魚的生長特征研究，根據(jù)本研究結果推測，雄魚偏窄的尾柄和體型可能使其更加靈活，擴大其生存優(yōu)勢。運用逐步判別分析所建立的雌雄判別方程，其對暗紋東方鲀雌雄個體綜合判別的正確率為81.1%，表明依據(jù)所選出的5個外形特征可以用于判別其性別，值得注意的是本方法仍具有一定局限性，所構建的方程對群體要求較高，由于不同群體生活環(huán)境等的差異，即使年齡相同也可能存在較大差異，因此在應用此法時最好根據(jù)所養(yǎng)殖的群體重新構建判別方程，以免造成較大誤差，在岳亮等［14］、吳波等［21］的研究中也表明了這一點。本研究從形態(tài)學方面，利用多元統(tǒng)計分析方法對暗紋東方鲀雌雄進行鑒定，耗時短、操作簡單、基本無需成本，在實際生產(chǎn)中降低了對技術人員的依賴性，是一種簡便可行的暗紋東方鲀性別鑒定方法，也為其他魚類性別鑒定提供了借鑒。