李茹霞，顧寅鈺，李萌，陳傳杰，梁曉艷，李俊林，邢延富，張海洋，付嬈

（1.山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺 264002；2.煙臺市福山區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 煙臺 265500）

土壤鹽漬化作為一個(gè)普遍的環(huán)境問題，已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的世界性難題［1，2］。對于大部分植物來說，高鹽脅迫的危害主要是由高濃度Na＋積累導(dǎo)致的。雖然不同植物的耐鹽機(jī)制存在差異，但其基本策略都是保持胞內(nèi)Na＋的平衡［3］。

離子和pH穩(wěn)態(tài)在植物生長發(fā)育的細(xì)胞過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，離子運(yùn)輸在生物過程的許多方面起著至關(guān)重要的作用，如離子的吸收或隔離、提供能量和細(xì)胞的擴(kuò)展。最佳離子和pH梯度取決于H＋轉(zhuǎn)運(yùn)酶和陽離子/H＋交換器［4］。在眾多的單價(jià)陽離子/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（CPA1）家族中，Na＋/H＋逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NHX）為二次離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，是離子轉(zhuǎn)運(yùn)體中的重要成員，在細(xì)胞的各個(gè)隔間中介導(dǎo)H＋與Na＋/K＋在膜上的交換轉(zhuǎn)運(yùn)［5］。根據(jù)已有研究，除了酵母只含有一個(gè)NHX基因外，所有已測序的真核生物都含有多個(gè)NHX家族成員，并被指定為Na＋/H＋交換器（NHEs）［6，7］。根據(jù)其家族成員的亞細(xì)胞定位，NHXs分為3類:定位于液泡膜上的（Vac－class）、定位于核內(nèi)體膜上的（Endo－class）和定位于質(zhì)膜上的（PMclass）［8］。在哺乳動(dòng)物中，NHXs的特殊亞細(xì)胞功能依賴于其器官特異性的分布［9］。

在擬南芥中，NHX家族由6個(gè)細(xì)胞內(nèi)基因（其中AtNHX1～AtNHX4屬于Vac－class，At-NHX5、AtNHX6屬于Endo－class）和2個(gè)質(zhì)膜結(jié)合基因（AtNHX7、AtNHX8）組成［10］。根據(jù)生化和動(dòng)力學(xué)分析，NHXs含有10～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在功能上可能具有同源二聚體功能［9］。雖然At-NHX1在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征上與其他已知的NHXs逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同，但根據(jù)疏水性分析，它仍然含有10～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域［11］。

NHXs基因參與多個(gè)生物過程，包括對外界鹽脅迫的響應(yīng)［10－12］，從植物體內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)［12，13］、K＋穩(wěn)態(tài)［14，15］、細(xì)胞擴(kuò)張［16，17］、細(xì)胞囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)方面影響植物的生長發(fā)育［4，9］。擬 南 芥nhx1nhx2雙突變體幼苗與單突變體和野生型幼苗相比，生長速度明顯降低；顯微觀察結(jié)果顯示，nhx1nhx2雙突變體各組織的細(xì)胞擴(kuò)張均明顯減弱，特別是在快速伸長的器官中，如花絲和黃化下胚軸［18］。另外，nhx1nhx2雙突變體對外源K＋敏感，表現(xiàn)出根卷曲、葉片黃化膨大等表型［18，19］。Endo亞家族的AtNHX5和AtNHX6定位于跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)（TGN），在囊泡運(yùn)輸（尤其是在液泡運(yùn)輸中）起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［7］。在鹽脅迫下，細(xì)胞外高濃度的鈉離子流入細(xì)胞，當(dāng)Na＋積累到有害水平時(shí)，PM亞家族的AtNHX（AtNHX7/SOS1）會主動(dòng)將Na＋排出細(xì)胞，而Vac亞家族的AtNHXs則介導(dǎo)Na＋進(jìn)入液泡，將Na＋隔離于液泡中［14］。

菠菜是重要的綠葉蔬菜之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。菠菜基因組測序的完成和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立［20－22］，使得菠菜重要基因的功能研究成為可能。NHXs在菠菜體內(nèi)的功能尤其是在維持Na＋平衡方面目前還沒有詳細(xì)研究報(bào)道。前期，我們通過生物信息學(xué)方法，從菠菜中鑒定出6個(gè)NHX家族基因，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及不同亞家族的基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果與擬南芥相似，但整個(gè)家族的基因數(shù)目少于擬南芥，該家族基因的生物學(xué)功能還未明確。為了探究菠菜NHXs在功能上的差異，本研究對其進(jìn)行了系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，可為進(jìn)一步研究菠菜NHXs基因的進(jìn)化和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菠菜品種為保存的山東小葉菠菜品種，2020年9月播種于山東省蠶業(yè)研究所植物光照培養(yǎng)箱中，待幼苗四葉一心時(shí)，分別置于正常條件及200 mmol/L NaCl脅迫條件下進(jìn)行處理，重復(fù)3次。處理0、3、6、12 h后選取幼嫩植株作為樣品，經(jīng)液氮速凍后，置－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菠菜NHX家族相關(guān)生物信息學(xué)分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

以已知的8個(gè)擬南芥NHX蛋白（TAIR，https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp）對菠菜基因組（SpinachBase，http://www.spinachbase.org/）進(jìn)行Blast，并通過SMART（http://smart.embl－h(huán)eidelberg.de/）和Pfam工具（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）鑒定菠菜NHX基因。使用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2）進(jìn)一步預(yù)測其跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)量。運(yùn)用在線軟件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖；運(yùn)用Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）在線網(wǎng)站進(jìn)行氨基酸數(shù)、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)等預(yù)測；采用MEME（http://meme－suite.org/tools/meme）進(jìn)行蛋白motif保守基序分析。通過TAIR與Phytozomev 12.1下載擬南芥（At）、水稻（Os）蛋白序列，使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（neighbor－joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化標(biāo)準(zhǔn)Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.3 總RNA的提取、引物設(shè)計(jì)和qRT－PCR分析

從菠菜基因組數(shù)據(jù)庫中下載SpoNHX基因家族的CDS序列，利用Primer Premier 5.0進(jìn)行熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)（表1），引物由華大生物工程股份有限公司（青島）合成。采用Trizol法提取總RNA，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000檢測RNA質(zhì)量以確?？俁NA的完整性和濃度。參照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第一鏈合成，置于－20℃保存?zhèn)溆?。qRT－PCR擴(kuò)增選用熒光定量專用試劑TransStart?Top Green qPCR SuperMix（＋DyeⅡ）（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。反應(yīng)體系（20 μL）:2×qPCR SuperMix 10μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，44個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增完全后溫度從65℃緩慢上升至95℃進(jìn)行熔解曲線繪制，上升速度為每0.05 s上升0.5℃。每次循環(huán)第3步進(jìn)行熒光采集，每個(gè)樣品重復(fù)3次，利用2－△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并使用SigmaPlot12.5繪制柱狀圖。

表1 菠菜NHX家族熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SpoNHX家族基因的鑒定和理化性質(zhì)分析

通過將擬南芥中的NHX家族基因?qū)Σげ嘶蚪M數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列比對，并經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域等分析，我們從菠菜中篩選到6個(gè)NHX家族基因，根據(jù)SpoNHX基因與AtNHX基因的親緣關(guān)系將其命名為SpoNHX1～SpoNHX6，其蛋白長度、等電點(diǎn)和相對分子質(zhì)量等見表2。其中，ORF長度在236～1 162個(gè)氨基酸殘基之間，等電點(diǎn)在4.64～9.11之間。

表2 SpoNHX家族基因信息及理化性質(zhì)

2.2 SpoNHXs的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

將擬南芥、水稻和菠菜的NHX氨基酸序列進(jìn)行比對，并用MEGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。結(jié)果表明，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹將3個(gè)物種的NHX蛋白聚類為3個(gè)亞家族（Vac、Endo和PM），Vac亞家族包含3個(gè)SpoNHXs、4個(gè)AtNHXs以及4個(gè)OsNHXs；Endo亞家族包含1個(gè)SpoNHX、2個(gè)AtNHXs以及2個(gè)OsNHXs；PM亞家族包含2個(gè)SpoNHXs、2個(gè)AtNHXs以及1個(gè)OsNHX（圖1）。該結(jié)果與其亞細(xì)胞定位結(jié)果相吻合。

圖1 菠菜、擬南芥、水稻的NHXs進(jìn)化樹

利用Phyre2在線網(wǎng)站對鑒定出的SpoNHXs蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，SpoNHX1～SpoNHX5含有13個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而SpoNHX6只有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖2 SpoNHX家族蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域

2.3 SpoNHX家族基因結(jié)構(gòu)、蛋白的保守基序

對SpoNHX家族成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明6個(gè)SpoNHXs基因結(jié)構(gòu)完整。SpoNHX1和SpoNHX2含有14個(gè)外顯子，SpoNHX3含有13個(gè)外顯子，SpoNHX4含有20個(gè)外顯子，SpoNHX5含有23個(gè)外顯子，SpoNHX6含有6個(gè)外顯子（圖3）。

圖3 SpoNHX家族基因結(jié)構(gòu)

利用MEME軟件搜索并對SpoNHXs氨基酸序列進(jìn)行保守基序分析，保守基序上限設(shè)置為15且允許序列中同一基序重復(fù)出現(xiàn)，結(jié)果（圖4）表明，SpoNHX與AtNHX不同亞家族保守基序基本一致，說明NHX成員間保守性較高；其中，Vac亞家族中的SpoNHX1和SpoNHX2含有11個(gè)保守基序，而SpoNHX3含有9個(gè)保守基序；Endo亞家族中的SpoNHX4含有8個(gè)保守基序；PM亞家族中的SpoNHX5含有9個(gè)保守基序，SpoNHX6含有3個(gè)保守基序。

圖4 SpoNHX家族蛋白基序分配

2.4 SpoNHXs基因鹽脅迫下的表達(dá)分析

為探索SpoNHXs對鹽脅迫的響應(yīng)，采用qRTPCR檢測該家族基因受鹽脅迫0、3、6、12 h的表達(dá)情況，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫后6個(gè)SpoNHXs基因均上調(diào)表達(dá)。其中SpoNHX1和SpoNHX6在鹽脅迫下表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在6 h時(shí)表達(dá)最高，與對照相比差異顯著；而SpoNHX2～SpoNHX5在鹽脅迫下呈現(xiàn)一直上升的趨勢，與對照相比差異不顯著。

圖5 鹽脅迫下SpoNHX家族基因表達(dá)情況

3 結(jié)論

隨著基因組測序和生物信息學(xué)研究的不斷深入，越來越多物種中的NHX家族基因被鑒定出來并得到系統(tǒng)分析。本研究從菠菜中鑒定出6個(gè)NHX基因，分屬于Vac、Endo、PM亞家族，其中，SpoNHX1、SpoNHX2、SpoNHX3屬于Vac亞家族，SpoNHX4屬于Endo亞家族，SpoNHX5和SpoNHX6屬于PM亞家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，SpoNHXs與擬南芥NHXs在進(jìn)化距離上較水稻NHXs更近，這可能與菠菜和擬南芥同屬于雙子葉植物而水稻屬于單子葉植物有關(guān)。SpoNHX1～SpoNHX5均含有13個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，SpoNHX6含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。菠菜和擬南芥NHXs在不同亞家族中保守結(jié)構(gòu)域高度一致，說明其可能具有相似的生物學(xué)功能。在鹽脅迫條件下，SpoNHXs均上調(diào)表達(dá)，其中SpoNHX1和SpoNHX6表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在脅迫處理6 h時(shí)顯著高于對照，說明這兩個(gè)基因在響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮著較為重要的作用。本研究結(jié)果為菠菜NHX家族基因的克隆及功能預(yù)測提供了一定的理論參考，并為菠菜耐鹽功能基因的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。