王曦,任金瑞,朱見深,李均同,吳香菊,戴美學,叢曉燕,侯云峰,呂強華,劉玉慶,杜以軍,齊靜
(1.山東師范大學生命科學學院,山東 濟南 250014;2.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疾病防治與繁育重點實驗室,山東 濟南 250100;3.山東金鑄基藥業(yè)有限公司,山東 濟南 271100)
腸炎沙門氏菌是養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)中一種重要致病菌,可引起早期雛雞大量死亡,在30日齡以后轉為隱性攜帶而難以致死,但伴隨著持續(xù)性排菌,對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1,2]??股厥丘B(yǎng)殖企業(yè)防治沙門氏菌的常用手段,但是抗生素的濫用導致大量耐藥菌的出現(xiàn),嚴重威脅公共衛(wèi)生安全[3,4]。隨著《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃(2017—2020年)》的出臺,一些具有減抗或降抗?jié)摿Φ募夹g快速發(fā)展,如糞菌移植(fecalmicrobiota transplantation)和噬菌體(phage)療法。
糞菌移植是將健康供體腸道中的功能菌群移植給患病受體,幫助患病受體重新建立腸道菌群結構,從而達到治療疾病、促進受體健康的目的[5]。已有研究表明糞菌移植可用于治療腸道相關疾病,清除大部分抗藥性機會致病菌(如人的復發(fā)性艱難梭菌感染和潰瘍性結腸炎)[6];促進宿主健康并提高其抗病能力[7]。其中健康安全的供體是糞菌移植中一個重要的基礎和前提[8]。
噬菌體是一種特異性侵染細菌并利用宿主的代謝機制進行復制的病毒,且不會對宿主動物體內(nèi)的正常微生物群產(chǎn)生負面影響[9]。因此,噬菌體療法在治療動物致病菌感染方面具有較大優(yōu)勢[10]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),使用噬菌體療法可以有效降低沙門氏菌感染導致的試驗雞的死亡率[11]。
有研究表明,將噬菌體與益生菌聯(lián)合使用比各自單獨應用能夠更有效地減少雛雞中的沙門氏菌[12]。健康成年個體的腸道菌群亦可以作為益生菌加以利用[13,14]。成年SPF雞的腸道菌群安全、敏感,以其作為供體進行糞菌移植可以降低受體雛雞中大腸桿菌的抗藥性水平[15]。但是由于SPF雞生活在封閉隔離的環(huán)境中,導致其腸道菌群較為單一,且利用SPF雞的糞菌移植在抵抗病原菌入侵方面的研究較少[16-18],因此本試驗采用糞菌移植與噬菌體結合療法,研究其對感染沙門氏菌的SPF雛雞的治療效果。其核心是:①給予幼齡動物健康成年動物的腸道菌群,使幼齡動物提前具備一定抵抗病原菌入侵的能力;②當幼齡動物感染致病菌時,再使用噬菌體療法來配合治療。本研究旨在評估糞菌移植與噬菌體結合療法的安全性與應用潛力。
試驗動物來自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所SPF雞胚場,供體動物為208日齡SPF成年雞2只,受體動物為1日齡SPF雛雞160只,隨機分為4組,每組40只。Ca組:每只雞在1日齡時口服0.1 mL PBS緩沖液;在3日齡時口服0.1 mL腸炎沙門氏菌液,約6.2×108cfu。Cb組:每只雞在1日齡和3日齡時口服0.1 mL PBS緩沖液。FPa組:每只雞在1日齡時口服0.1 mL糞菌移植液;3日齡時,每只雞口服6.2×108cfu腸炎沙門氏菌液;攻毒2 h后,口服0.1 mL噬菌體混合液,約1.38×108pfu;8日齡時,每只雞再次口服等量的噬菌體混合液。FPb組:每只雞在1日齡時口服0.1 mL糞菌移植液;3日齡時,每只雞口服0.1 mL PBS緩沖液;2 h后,口服0.1 mL噬菌體混合液,約1.38×108pfu;8日齡時,每只雞再次口服等量的噬菌體混合液。接受糞菌移植與噬菌體的組統(tǒng)稱為FP組;未接受糞菌移植與噬菌體的組統(tǒng)稱為C組;攻毒的組統(tǒng)稱為a組;未攻毒的組統(tǒng)稱為b組。各組分別在隔離器內(nèi)隔離飼養(yǎng)至40日齡,正常飼喂雛雞飼料和飲水。
無菌采集兩只成年SPF雞的新鮮盲腸內(nèi)容物放入50 mL無菌離心管中,以1∶10(g/mL)的比例與無菌PBS緩沖液(內(nèi)含10%的甘油)混合,振蕩均勻,1 800 r/min離心10 min,將離心后所得懸液經(jīng)滅菌三層濾布(紗布、0.2 mm濾布、0.1 mm濾布)過濾,最終獲得均一、棕色的糞菌移植供體菌液,直接用于糞菌移植;或置于-80℃凍存,使用之前在冰水浴中提前2~4 h融化,可用于糞菌移植操作。
將實驗室保存的腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)解凍,用接種環(huán)蘸取一環(huán)在LB固體培養(yǎng)基上劃線后置于恒溫培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)24 h,獲得沙門氏菌單菌落。挑取單菌落置于裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中,37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)8 h左右,離心后棄上清,使用無菌PBS緩沖液洗滌2次,分光光度計初測OD600值,適當稀釋使OD600在1.0左右,菌液濃度約為109cfu/mL。隨后用PBS緩沖液進行倍比稀釋,利用微量平板稀釋法[19]精確計算攻毒菌液的實際劑量為每只雞6.2×108cfu。
選擇實驗室分離保存的兩株沙門氏菌噬菌體(編號為2-2G和3G),參照文獻[20]中的方法進行活化富集,利用雙層平板法測得2-2G的效價為8.6×108pfu/mL,3G的效價為9.52×109pfu/mL。吸取等量的兩種噬菌體液置于同一個離心管中振蕩混勻后,檢測其混合效價為1.38×109pfu/mL。
每天觀察并記錄試驗雞的生存狀況,繪制生存曲線。在第11、19、40日齡時每組隨機選擇4只雞,稱量體重,記錄體重的變化情況。
將第11、19、40日齡每組隨機采集的4只SPF雞經(jīng)頸動脈放血致死,收集血液,分離血清,并無菌剖檢,采集空腸和肝臟組織,分別進行如下指標的檢測。
1.6.1 細胞因子檢測 將收集的血液在4℃冰箱靜置24 h,4 000 r/min離心8 min,收集血清,-20℃保存。使用江蘇晶美生物科技有限公司生產(chǎn)的雞白細胞介素1β(IL-1β)、雞白細胞介素18(IL-18)和雞γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒檢測3個日齡各組SPF雞血清中3種細胞因子的變化,具體步驟按照試劑盒說明書進行。
1.6.2 腸道絨毛長度、隱窩深度以及肝臟病理變化 將收集的空腸(鄰近回腸的部分,約1 cm)和肝臟組織(每只雞無菌取指甲大小2片)分別放入盛有1 mL多聚甲醛的離心管中進行固定,送武漢賽維爾生物科技有限公司進行病理切片的制備,檢測3個日齡各組SPF雞的腸道絨毛長度和隱窩深度,并描述肝臟的病理變化。
1.6.3 肝臟組織中沙門氏菌的定性檢測 在40日齡,各組無菌采集步驟1.6中2只SPF雞的肝臟組織,利用DNA提取試劑盒(BioFlux)提取肝臟組織中總DNA,用PCR方法對各組肝臟組織中沙門氏菌進行定性檢測。用于鑒定沙門氏菌的目的基因為FimW基因,引物序列[21]如表1所示,由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。
表1 擴增腸炎沙門氏菌FimW基因的PCR引物序列
PCR擴增體系(16μL):2×TaqPCR Master-Mix緩沖液8μL,上游與下游引物各1μL,無菌去離子水4μL,DNA模板2μL。PCR反應程序:95℃預變性3 min;95℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測并測序,分析沙門氏菌在肝臟中的定殖情況。
采用軟件GraphPad Prism 7.0繪制生存曲線,利用Mann-Whitney檢驗進行差異顯著性分析。
3日齡進行腸炎沙門氏菌攻毒之后,Ca組在5日齡至13日齡共死亡13只,30日齡時死亡1只,之后無死亡現(xiàn)象,除去試驗期間處死的12只,最后Ca組剩余14只存活;其他3組均無死亡現(xiàn)象(圖1A)??傮w來看,Ca組受沙門氏菌攻毒的影響較大,體重較其他組更低。在11日齡和19日齡,F(xiàn)Pb組體重顯著高于C組(P<0.05);40日齡時,F(xiàn)P組與Cb組的體重無顯著差異(P>0.05),但三者體重均顯著高于Ca組(P<0.05)(圖1B)。
圖1 各組SPF雞的生存曲線與體重變化
在11日齡和40日齡,Ca組SPF雞血清中的IFN-γ濃度顯著高于其他3組(P<0.05),且FP組與Cb組無顯著差異(P>0.05);只有Ca組血清中IFN-γ濃度隨著日齡的增加而顯著增加(P<0.05),其他3組隨著日齡的增加無顯著變化(P>0.05,圖2A)。11日齡至40日齡,Ca組的IL-1β濃度顯著高于b組(P<0.05),F(xiàn)Pa組與Ca組無顯著差異(P>0.05);各組血清中IL-1β的濃度隨著日齡的推移無顯著變化(P>0.05,圖2B)。11日齡和19日齡,Ca組中IL-18的濃度顯著高于Cb組(P<0.05),b組間無顯著差異(P>0.05),40日齡時各組中IL-18的濃度無顯著差異(P>0.05);Ca組IL-18濃度隨日齡推移而顯著下降(P<0.05),其他3組IL-18濃度隨著日齡推移無顯著變化(P>0.05,圖2C)。
圖2 3個日齡3種細胞因子的比較
Cb組和FPb組的肝臟組織切片中未觀察到明顯的病變(圖3A-F)。FPa組只在11日齡局部可見淋巴細胞灶性浸潤(黑色箭頭,圖3G),19日齡和40日齡時沒有觀察到病變(圖3H、I)。在11、19、40日齡時,Ca組的肝臟組織中均可見明顯的淋巴細胞灶性浸潤(黑色箭頭,圖3J-L)。
圖3 各組SPF雞肝臟病理切片(200×)
PCR擴增結果(圖4)表明,只有Ca組出現(xiàn)了目的條帶,且測序結果與目的條帶大小一致,說明在40日齡時,除Ca組外,其它3組肝臟中均沒有腸炎沙門氏菌的定殖。
圖4 40日齡各組SPF雞肝臟中沙門氏菌的定性檢測
在3個日齡中,C組間的腸道絨毛長度始終無顯著差異(P>0.05),F(xiàn)P組間的腸道絨毛長度也無顯著差異(P>0.05)。11日齡時,各組間的腸道絨毛長度無顯著差異(P>0.05);19日齡和40日齡時,F(xiàn)P組的腸道絨毛長度均顯著高于C組(P<0.05)。FP組的腸道絨毛長度隨著日齡的增加而顯著增加(P<0.05),而C組的腸道絨毛長度隨著日齡的增加無顯著變化(P>0.05,圖5A)。隨著日齡的推移,Ca組的隱窩深度逐漸高于Cb組(P<0.05),各組的隱窩深度隨著日齡的增加而降低(圖5B)。各組腸道絨毛長度與隱窩深度的比值(V/C)如圖5C所示,在11日齡,各組間的V/C值無顯著差異(P>0.05);在19日齡,Cb組和FP組間的V/C值無顯著差異(P>0.05),且都顯著高于Ca組(P<0.05);40日齡,F(xiàn)P組的V/C值顯著高于Ca組(P<0.05),Cb組的V/C值與其他3組均無顯著差異(P>0.05)。各組V/C值均隨著日齡的增加而增加。
圖5 3個日齡下的腸道絨毛長度與隱窩深度
從各組受體動物表現(xiàn)上來看,糞菌移植與噬菌體的結合療法有效降低了感染沙門氏菌的雛雞死亡。11日齡和19日齡時,F(xiàn)Pb組的體重顯著高于C組(P<0.05),表明糞菌移植與噬菌體的結合療法對SPF雛雞的生長起到了促進作用。40日齡時,F(xiàn)P組與Cb組的體重無顯著差異(P<0.05),且都顯著高于Ca組(P<0.05),3個日齡Ca組的體重始終低于其他組。這表明腸炎沙門氏菌感染導致了SPF雛雞生長速率變慢,而糞菌移植與噬菌體結合療法使感染腸炎沙門氏菌的雛雞體重恢復到正常水平。
腸炎沙門氏菌入侵會刺激機體中促炎因子與趨化因子分泌的增加,如:IL-1β、IL-18和IFN-γ等[22]。本研究中,腸炎沙門氏菌的入侵促進了動物體內(nèi)IFN-γ、IL-1β和IL-18的釋放。3個日齡中,b組間3種細胞因子的濃度基本無顯著性差異(P>0.05),說明糞菌移植與噬菌體的結合治療并沒有引起SPF雞全身的炎癥反應。11日齡和40日齡,F(xiàn)Pa組IFN-γ的濃度顯著低于Ca組(P<0.05);11日齡至40日齡,F(xiàn)Pa組中IL-1β的濃度與Ca組無顯著性差異(P>0.05);11日齡,F(xiàn)Pa組中IL-18的濃度顯著低于Ca組(P<0.05),19日齡至40日齡,Ca組IL-18的濃度下降,與FPa組無顯著性差異(P>0.05)。這可能是因為糞菌移植與噬菌體的結合療法對SPF雛雞的免疫能力起到了一定增強作用。
沙門氏菌的感染不限于腸道,它們能夠存在于巨噬細胞豐富的肝臟中[23],并引起肝臟組織損傷,導致炎癥反應與灶性病變[24]。本研究中Ca組3個日齡的肝臟均出現(xiàn)了炎性病變,F(xiàn)Pa組只在11日齡發(fā)現(xiàn)炎性病變,說明糞菌移植與噬菌體的結合療法減少了沙門氏菌導致的雛雞肝臟的炎性病變。
通過收集雛雞肝臟樣品進行檢測是沙門氏菌感染的常規(guī)診斷方法之一[25]。通過對各組SPF雞40日齡的肝臟進行DNA提取和PCR反應,發(fā)現(xiàn)只有在Ca組中檢出沙門氏菌特有的FimW基因。這表明糞菌移植與噬菌體的結合療法清除了腸炎沙門氏菌在肝臟中的定殖,起到了抵抗腸炎沙門氏菌感染的作用。
腸道絨毛長度、隱窩深度和絨毛長度與隱窩深度的比值可用來比較各組SPF雞的消化吸收能力[26]。本研究中FP組的腸道絨毛長度及其與隱窩深度的比值均隨著日齡的推移顯著高于Ca組(P<0.05);與其他3組相比,Ca組的隱窩深度在3個日齡均處于最高水平。這表明腸炎沙門氏菌的感染抑制了SPF雛雞腸道絨毛的生長以及導致隱窩深度增高,而糞菌移植與噬菌體的結合療法不僅改善了感染沙門氏菌的雛雞腸道絨毛的發(fā)育情況,還能促進正常雛雞腸道絨毛的生長,增強了雛雞消化吸收能力。
本研究表明糞菌移植與噬菌體的結合療法在一定程度上提高了雛雞的免疫水平,減少了因感染沙門氏菌導致的雛雞肝臟的炎性病變,清除了沙門氏菌在肝臟中的定殖,增強了雛雞的消化吸收能力,降低了死亡率,促進了體重增長,保護了雛雞度過幼齡虛弱期,是減少抗生素使用的可行途徑,為糞菌移植與噬菌體的結合療法在抵抗動物病原菌的感染方面提供了參考依據(jù)。