梁俊超，劉曉東，袁 飛，李 坤，劉紅祥，馬振乾，胡繼明，劉 東*，于 錄(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 13006; .動(dòng)物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/青島易邦生物工程有限公司，山東 青島 66000)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種急性、高度接觸性傳染病，該病病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，臨床發(fā)病主要以繁殖障礙及呼吸道癥狀為主，多表現(xiàn)為公豬精液質(zhì)量差，母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及產(chǎn)后發(fā)情不規(guī)則，商品豬高燒、呼吸障礙且死淘率高[1-3]。

1987年，美國首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)PRRS[4]，1996年我國首次報(bào)道從疑似病例中分離得到PRRSV[5]，從而也證實(shí)PRRS已傳入我國。2006年后，我國出現(xiàn)高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)，該類毒株毒力增強(qiáng)，造成養(yǎng)豬業(yè)重大死傷，導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[6]。2010年，廣東某豬場仔豬血清中分離得到GM2毒株，GM2毒株以QYYZ毒株和MLV毒株為親本，但在豬體內(nèi)的復(fù)制能力高于親本，致病性相對(duì)更高[7]。2013年我國已有報(bào)道豬群因感染NADC 30-like毒株導(dǎo)致重胎期母豬大面積流產(chǎn)[8]。2014年后，NADC30-like毒株臨床檢出率逐年升高，國內(nèi)流行態(tài)勢加劇，且在某些區(qū)域成為優(yōu)勢毒株[9]。目前，國內(nèi)田間流行藍(lán)耳野毒毒株愈加復(fù)雜多樣，這也為我國藍(lán)耳病防控帶來全新挑戰(zhàn)。

GP5蛋白是由PRRSV的ORF5基因編碼的高度糖基化的囊膜蛋白，PRRSV的主要中和位點(diǎn)位于GP5蛋白[10]。GP5蛋白是PRRSV中變異程度最大的結(jié)構(gòu)蛋白之一，通常作為 PRRSV變異的主要依據(jù)之一，而GP5基因序列的變化可在一定程度反映藍(lán)耳流行毒株的遺傳變異情況[11]。因基因組差異，PRRSV被分為歐洲型(基因Ⅰ型，代表毒株LV株)和北美型(基因Ⅱ型，代表毒株VR-2332株)?；谌騊RRSV分類系統(tǒng)和GenBank中的ORF5序列信息，我國普遍存在的北美型(基因Ⅱ型)PRRSV毒株被分為四大譜系：譜系1，譜系3，譜系5和譜系8，譜系1代表毒株為NADC30和MN184，譜系3代表毒株為GM2，譜系5代表毒株為經(jīng)典毒株VR2332和MLV，而譜系8又被細(xì)分為5個(gè)亞群，亞群Ⅰ代表毒株為經(jīng)典毒株CH-1a，亞群Ⅱ?yàn)榻?jīng)典和HP-PRRSV的中間亞群，代表毒株為BJ0706，亞群Ⅲ-Ⅴ為HP-PRRSV及其衍生株，代表毒株為JXA1、TJ和HuN4[12]。

對(duì)2019年我國8省46份PRRSV陽性樣品中PRRSV毒株進(jìn)行ORF5基因測序，并比對(duì)分析PRRSV遺傳進(jìn)化，為以后PRRS的流行趨勢及防控提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 病毒樣品

2019年從我國8個(gè)省(包括山東、江蘇、安徽、寧夏、遼寧、云南等)采集的疑似 PRRSV感染的臨床樣品按照文獻(xiàn)[13]介紹的RT-PCR方法進(jìn)行檢測。利用病毒RNA提取試劑盒(TAKARA公司)提取總RNA，并用RT試劑盒(羅氏公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

利用ORF5基因引物(上游：CATTTCATGACACCTGAGACCA；下游：AGAGCATATATCATCACTGGCG)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：94 ℃變性2 min后進(jìn)入循環(huán)：94 ℃15 s，54 ℃30 s，68 ℃1 min，32個(gè)循環(huán)后，68 ℃10 min。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒購于TAKARA公司；高保真反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于羅氏公司；LATaq DNA聚合酶購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 PRRSV GP5測序

將RT-PCR陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 分子進(jìn)化分析

通過序列分析軟件DNAstar Lasergene對(duì)所選毒株的ORF5基因進(jìn)行序列同源性的比對(duì)分析，利用MEGA6軟件對(duì)所測ORF5序列制作進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測及測序結(jié)果

對(duì)送檢樣品的ORF5基因進(jìn)行 RT-PCR檢測，目的條帶大小為603 bp，出現(xiàn)目的條帶表明所檢樣品PRRSV為陽性(圖1)。從8省送檢的PRRSV抗原陽性樣品中，隨機(jī)挑選46份PRRSV的PCR產(chǎn)物進(jìn)行ORF5基因測序，經(jīng)比對(duì)后確認(rèn)得到46個(gè)PRRSVORF5基因序列，各省PRRSV樣品測序數(shù)量詳見表1。

圖1 PRRSV RT-PCR檢測結(jié)果Fig. 1 Results of PRRSV RT-PCR detection

表1 PRRSV送檢測序數(shù)量及區(qū)域分布Table 1 The number and regional distribution of PRRSV submitted for sequencing

2.2 PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性比對(duì)及進(jìn)化分析

樣品序列結(jié)果按照“送檢年月-樣品編號(hào)-送檢省份縮寫”進(jìn)行編號(hào)。46份樣品的PRRSVORF5基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序所得46個(gè)603 bp的ORF5基因序列，與譜系1、3、5和8的標(biāo)準(zhǔn)毒株通過DNAstar和MEGA6軟件進(jìn)行比對(duì)，與標(biāo)準(zhǔn)毒株同源性比對(duì)結(jié)果見表2。46個(gè)PRRSVORF5序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株的進(jìn)化樹見圖2。由表3可見，8個(gè)省46個(gè)測序樣品的PRRSV分布在譜系1、譜系3和譜系8中，其中譜系1有19個(gè)，譜系3僅2個(gè)，譜系8有25個(gè)且全屬于亞群Ⅲ-Ⅴ。山東1～6月份譜系1中樣品PRRSV僅2個(gè)，而7～12月份為10個(gè)，NADC 30-like毒株檢出量明顯增多，而譜系8中樣品在1～6月份和7～12月份檢出量無明顯差異。

表2 46個(gè)PRRSV ORF5基因序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株同源性對(duì)比Table 2 The homology of 46 PRRSV ORF5 gene sequences compared with the standard strains

表3 46個(gè)PRRSV ORF5基因序列譜系及區(qū)域分布Table 3 Lineage and regional distribution of 46 PRRSV ORF5 gene sequences

圖2 46個(gè)PRRSV ORF5基因序列進(jìn)化樹分析Fig. 2 Evolutionary tree analysis of 46 PRRSV ORF5 gene sequences

2.3 PRRSV GP5蛋白氨基酸變異分析

46個(gè)PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列主要以點(diǎn)突變?yōu)橹?，未見插入突變，氨基酸同源性分析結(jié)果見圖3。美洲型PRRSV毒株GP5蛋白有2個(gè)重要的表位結(jié)構(gòu)，分別是誘餌表位(27～30 aa)和中和表位(37～45 aa)，其中誘餌表位是非中和表位[14-16]。在誘餌表位區(qū)域，譜系1中14個(gè)樣品PRRSV在第27位氨基酸發(fā)生變異V27A，2個(gè)樣品PRRSV在第28位氨基酸發(fā)生變異L28P和L28F，4個(gè)樣品PRRSV在第30位氨基酸發(fā)生變異N30S，3個(gè)樣品PRRSV在第29和30位氨基酸發(fā)生變異V29A和N30G；譜系3中2個(gè)樣品PRRSV在第27和30位氨基酸發(fā)生變異V27A和N30S；譜系8中2個(gè)樣品PRRSV在第30位氨基酸發(fā)生變異N30D。

圖3 46個(gè)PRRSV GP5蛋白氨基酸同源性分析Fig. 3 Amino acid homology analysis of 46 PRRSV GP5 proteins

在中和表位區(qū)域，譜系1中19個(gè)樣品PRRSV在第39位氨基酸均發(fā)生變異I39L，其中201912-587-SD毒株在38位氨基酸還發(fā)生變異H38N，譜系3中2個(gè)樣品PRRSV均在第38和39位氨基酸發(fā)生變異H38Y和I39S，而譜系8中，201911-514-AH在第41位氨基酸發(fā)生變異L41S。

GP5具有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，N32或N33或N34位于膜外結(jié)構(gòu)域的高變區(qū)且只存在于部分毒株中，此外，N44和N51也是糖基化位點(diǎn)[17]。46個(gè)PRRSV的GP5蛋白的N-糖基化位點(diǎn)N44N51未發(fā)生變化，而不同PRRSV的N-糖基化位點(diǎn)N33N34發(fā)生明顯變異。譜系1代表毒株NADC 30為N32N34，MN184B為N34，19個(gè)樣品PRRSV中，8個(gè)PRRSV為N32，2個(gè)為N33N34，2個(gè)為N34，1個(gè)為N32N34，2個(gè)為N32N33，3個(gè)為N33，而21912-586-HB無N33N34；譜系3中代表毒株GM2和2個(gè)樣品PRRSV均為N32N34；譜系8中代表毒株JXA1、HuN4和TJ均為N33N34N35，25個(gè)樣品毒株中，20個(gè)為N33N34N35，2個(gè)為N35，2個(gè)為N32N34，1個(gè)為N34N35。

3 討 論

PRRSV是我國養(yǎng)豬業(yè)重要防控疾病之一，由于PRRSV基因組易變異，導(dǎo)致新基因型毒株不斷出現(xiàn)。隨著田間流行野毒毒株多樣化，疫苗毒株與野毒毒株同源性差異加大，而野毒毒株抗原表位及中和表位出現(xiàn)突變，最終將導(dǎo)致目前商品化PRRS疫苗免疫效果受限[18-20]。

8省共46個(gè)樣品PRRSVORF5基因送經(jīng)測序可知，山東、遼寧、河北的樣品PRRSV分布在譜系1和譜系8中，安徽的樣品PRRSV分布在譜系1、3和8中，江蘇、寧夏、云南的樣品PRRSV分布在譜系8中，且均為HP-PRRSV，吉林僅測一個(gè)且在譜系1中，譜系1中樣品PRRSV共19個(gè)，譜系8中樣品PRRSV共25個(gè)，該結(jié)果表明國內(nèi)HP-PRRSV雖仍占一定優(yōu)勢，但NADC 30-like毒株流行已明顯加劇。

山東送檢測序共19個(gè)品PRRSV，其中12個(gè)屬于譜系1，7個(gè)屬于譜系8，且在7～12月份NADC 30-like毒株檢出明顯高于1～6月份，該結(jié)果表明山東NADC 30-like毒株流行相比HP-PRRSV呈現(xiàn)加劇趨勢，且下半年流行態(tài)勢高于上半年。

46個(gè)樣品毒株與經(jīng)典PRRS疫苗毒株如VR2332、MLV及CH-1R同源性相對(duì)較遠(yuǎn)，理論上PRRSV同源性高低影響PRRS疫苗毒株的田間保護(hù)效果[21]。GP5蛋白誘餌表位相對(duì)于中和表位是優(yōu)勢表位，會(huì)優(yōu)先被機(jī)體識(shí)別，對(duì)中和表位有屏蔽作用，導(dǎo)致中和抗體產(chǎn)生延遲，有利于PRRSV逃避機(jī)體免疫清除而大量增殖[22]。46個(gè)樣品PRRSV中共有17個(gè)PRRSV誘餌表位發(fā)生變異，氨基酸變異位點(diǎn)分別為V27A、L28P、L28F、V29A、N30S、N30G和N30D，誘餌表位變異可能有利于病毒免疫逃避。GP5蛋白中和表位能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，而該蛋白免疫識(shí)別位點(diǎn)的變異可影響中和抗體效果及疫苗的交叉保護(hù)率[10，23]，46個(gè)樣品PRRSV中22個(gè)PRRSV的中和表位發(fā)生變異，氨基酸變異位點(diǎn)分別為H38N、H38Y、I39L、I39S和L41S，22個(gè)樣品分別屬于譜系1、3和8?，F(xiàn)在國內(nèi)流行的NADC-like毒株、GM2-like毒株及HP-PRRSV毒株的中和表位確存在變異而且變異位點(diǎn)存在差異，這可能導(dǎo)致疫苗對(duì)田間不同流行野毒毒株的交叉保護(hù)力下降。

糖基化屏蔽是PRRSV一種免疫逃避機(jī)制，可避免被機(jī)體內(nèi)中和抗體清除，而GP5膜外區(qū)多糖位點(diǎn)缺失能夠提高抗體的中和能力和其附近中和表位的免疫原性[17，24]。46個(gè)樣品PRRSV的N-糖基化位點(diǎn)N44N51均未發(fā)生變化，而N33N34發(fā)生不同變異，其中8個(gè)樣品PRRSV為N32，2個(gè)為N33N34，2個(gè)為N34，5個(gè)為N32N34，2個(gè)為N32N33，3個(gè)為N33，20個(gè)為N33N34N35，2個(gè)為N35，1個(gè)為N34N35，1個(gè)為N33N34。20個(gè)樣品PRRSV為HP-PRRSV，且多糖位點(diǎn)增加，這可能降低高中和表位免疫原性及抗體中和能力；14個(gè)樣品PRRSV為NADC30-like PRRSV，且多糖位點(diǎn)減少，這可能提高高中和表位免疫原性及抗體中和能力。

4 結(jié) 論

通過以上研究可知，我國現(xiàn)階段流行的藍(lán)耳毒株呈現(xiàn)多樣化、復(fù)雜化，不同譜系毒株間誘餌表位、中和表位及糖基化位點(diǎn)均存在一定的差異，從而疫苗與野毒交叉保護(hù)力受限，最終導(dǎo)致單純依賴疫苗免疫防控難度加大。結(jié)合臨床，藍(lán)耳病更需綜合防控，首先要重視和提升豬場生物安全及飼養(yǎng)管理水平，然后了解豬場自身PRRSV感染實(shí)際情況，選擇與豬場PRRSV同源性近、安全性高且免疫原性好的疫苗進(jìn)行免疫，綜合防控才能有效防控藍(lán)耳病。