魏 鳳，張文通，唐 娜，王 艷，管 宇，祖立闖，王金良，苗立中*，沈志強(qiáng)*(.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 56600；.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 56600)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)是一種無囊膜的雙股DNA病毒，直徑大小為60～90 nm，屬于腺病毒科禽腺病毒屬。依據(jù)限制性內(nèi)切酶消化模式與血清交叉中和試驗(yàn)的不同，I群禽腺病毒(FAdV-I)又分為5個亞群(A-E)、12個血清型(FAdV1-11，其中FAdV-8分為a和b兩型)，可以引起禽類的多種疾病，包括包涵體肝炎、心包積液綜合征和雞胃糜爛[1-2]。雞肝炎-心包積液綜合征(Hepatitis and hydropericardium syndrome，HHS)是由禽腺病毒4型引起的主要侵害肉仔雞的一種病毒性傳染病。本病首次于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)發(fā)生[3]，隨后在亞洲、歐洲和南美洲等地區(qū)流行[4-5]。2015年以來該病在我國山東、江蘇、河南、安徽等地廣泛流行，可感染不同日齡、不同品種雞，發(fā)病死亡情況因地區(qū)、品種而異，對3～5周齡肉雞的致死率高達(dá)40%～100%，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6-9]。

目前，預(yù)防禽腺病毒病的根本措施是疫苗免疫[10]。有研究報道利用雞胚和雞胚原代肝細(xì)胞培養(yǎng)FAdV-4制備滅活全病毒油乳劑疫苗，并在臨床起到了較好的保護(hù)效果[11]。但該培養(yǎng)方法培養(yǎng)的病毒滴度較低，而且培養(yǎng)工藝繁瑣，不能滿足疫苗規(guī)?；a(chǎn)需要。篩選易培養(yǎng)、培養(yǎng)FAdV-4滴度高的細(xì)胞系，并對病毒培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，將有利于研發(fā)新型高效疫苗。本試驗(yàn)通過用不同的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)FADV-4濱州株從而篩選出最適應(yīng)細(xì)胞株，并對其培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，以克服現(xiàn)有病毒增殖上存在的不足，為進(jìn)一步開展禽腺病毒流行病學(xué)調(diào)查及疫苗毒株的培育提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

FADV-4濱州株由筆者分離保存； Vero細(xì)胞、QT-35細(xì)胞、DF-1細(xì)胞、LMH細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司、DMEM/F-12購自GIBCO公司；新生牛血清購自天津康源生物技術(shù)有限公司、胎牛血清購自Hyclone生物工程公司；胰酶為Sigma公司產(chǎn)品；核酸提取試劑盒和DNA Marker DL2000購自寶生物工程(大連)有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(MC015AC)購自山東愛博科技貿(mào)易有限公司、倒置顯微鏡(XDS-IB)購自重慶光電儀器有限公司、電熱恒溫培養(yǎng)箱購自黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司。

1.3 適應(yīng)性細(xì)胞的篩選

將前期分離保存的FADV-4濱州株按1%比例分別接種長滿單層的LMH細(xì)胞、Vero細(xì)胞、QT-35細(xì)胞和DF-1細(xì)胞，同時設(shè)空白細(xì)胞對照，吸附1.5 h后補(bǔ)加細(xì)胞維持液，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96 h，每天觀察細(xì)胞，待約85%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時收獲，按此方法連續(xù)傳3代(F1-F3)。

LMH細(xì)胞、Vero細(xì)胞、QT-35細(xì)胞和DF-1細(xì)胞分別按1∶3的比例傳代時，細(xì)胞計數(shù)后，按1.5×105個/mL的細(xì)胞濃度，分別制備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。將其F3代培養(yǎng)物分別用DMEM做10倍系列稀釋(10-1～10-8)，接種對應(yīng)的長滿單層的96孔細(xì)胞板中，每個稀釋度接種8個孔，0.1 mL/孔。同時設(shè)健康細(xì)胞對照。置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，每天觀察細(xì)胞病變情況。按照Reed-Muench法計算病毒含量(TCID50。)

1.4 LMH細(xì)胞的優(yōu)選、克隆優(yōu)化

將長滿單層的LMH細(xì)胞用0.25%的胰酶進(jìn)行消化分散，細(xì)胞計數(shù)后，按15×104/mL的細(xì)胞數(shù)接種于T25細(xì)胞瓶中，輕輕搖勻后，放置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min后，棄去培養(yǎng)液，補(bǔ)加10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，重置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

將培養(yǎng)72 h的LMH細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、重懸后，添加15%胎牛血清的DM/F12培養(yǎng)基稀釋成10個細(xì)胞/mL，充分混勻后，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.1 mL/孔，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d，更換新配制的15%胎牛血清的DM/F12培養(yǎng)基，0.2 mL生長液/孔，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 d，待細(xì)胞長滿單層后，選取單個細(xì)胞狀態(tài)良好的細(xì)胞，進(jìn)行消化，計數(shù)。重復(fù)上述步驟，進(jìn)行LMH細(xì)胞的克隆純化，直到獲得無細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)、透亮、輪廓清晰的細(xì)胞，液氮凍存一部分。同時進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞能穩(wěn)定傳代后，進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，將培養(yǎng)基換成普通的DMEM，血清換成7%新生牛血清，同時添加0.5%雞血清，在恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.5.1 不同接毒劑量對TCID50的影響 將克隆優(yōu)化后的LMH細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按3×105/mL的細(xì)胞密度，制備出11瓶LMH細(xì)胞(T25)。待細(xì)胞長滿單層后，按不同接毒量接種病毒。共分5組，每組兩瓶。分別按1/100、 1/200、 1/400、 1/800、 1/1000接種病毒。同時設(shè)1瓶空白細(xì)胞對照。接種病毒后的細(xì)胞和對照細(xì)胞均放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變，當(dāng)每瓶細(xì)胞有85%發(fā)生細(xì)胞病變時，收獲病毒液，置于-80 ℃冰箱中凍融3次。按此方法連續(xù)傳3代后，測定病毒含量，按照Reed-Muench法計算TCID50。分別計算每瓶毒液的TCID50，算出平均值，數(shù)據(jù)取lg值，用Excel軟件制圖。

1.5.2 不同吸附時間對TCID50的影響 將克隆優(yōu)化后的LMH細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，按3×105/mL的細(xì)胞密度，制備出11瓶LMH細(xì)胞(T25)。待細(xì)胞長滿單層后，按1/1000接毒量接種病毒，分別置于37 ℃培養(yǎng)箱中吸附0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，然后加入含2%新生牛血清的DMEM維持液。同時設(shè)1瓶空白細(xì)胞對照。接種病毒后的細(xì)胞和對照細(xì)胞均放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變，當(dāng)每瓶細(xì)胞有85%發(fā)生細(xì)胞病變時，收獲病毒液，置于-80 ℃冰箱中凍融3次。按此方法連續(xù)傳3代后，測定TCID50，方法同1.5.1。

1.5.3 不同收獲時間對病毒含量的影響 將克隆優(yōu)化后的LMH細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行克隆傳代，按3×105/mL的細(xì)胞密度，制備出7瓶LMH細(xì)胞(T25)。待細(xì)胞長滿單層后，按1/1000接毒量接種病毒，分別置于37 ℃培養(yǎng)箱中吸附1 h，然后加入含2%新生牛血清的DMEM維持液。同時設(shè)1瓶空白細(xì)胞對照。接種病毒后的細(xì)胞和對照細(xì)胞均放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至24 h、36 h、48 h時分別收獲2瓶接毒細(xì)胞，放置于-80 ℃冰柜凍融3次。按此方法連續(xù)傳3代后，測定TCID50，方法同1.5.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 適應(yīng)性細(xì)胞的篩選結(jié)果

FADV-4濱州株接種DF-1細(xì)胞盲傳三代無細(xì)胞病變可見，在LMH細(xì)胞、Vero細(xì)胞、QT-35細(xì)胞上均能看到明顯的細(xì)胞病變，其中在LMH細(xì)胞上接種24 h就有約60%的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，36 h約有80%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，病變特征主要表現(xiàn)為：細(xì)胞變圓、聚集成不規(guī)則葡萄串狀，細(xì)胞間隙增大。在Vero細(xì)胞和QT-35細(xì)胞上細(xì)胞病變出現(xiàn)的慢，培養(yǎng)48 h時約有50%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，其病變特征為：細(xì)胞聚集、融合成合胞體(圖1)。在LMH、Vero和QT-35細(xì)胞上培養(yǎng)三代的病毒含量分別為107. 5TCID50/0.1 mL、104.875TCID50/0.1 mL、106. 25TCID50/0.1 mL(表1)。根據(jù)在不同細(xì)胞上培養(yǎng)時產(chǎn)生病變的時間、病變特征及病毒含量，確定LMH細(xì)胞為該毒株的最適宿主細(xì)胞。

表1 病毒適應(yīng)性培養(yǎng)觀察及TCID50測定結(jié)果Table 1 Observation of virus adaptive culture and determination of TCD50

2.2 LMH細(xì)胞的克隆優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果，LMH細(xì)胞較適宜該分離毒株的培養(yǎng)。但LMH細(xì)胞不易培養(yǎng)，優(yōu)化前需用專用培養(yǎng)基加胎牛血清、置5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。經(jīng)過克隆、優(yōu)化培養(yǎng)后獲得了無細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)、透亮、輪廓清晰的細(xì)胞，細(xì)胞的生長速度和細(xì)胞密度都較優(yōu)化前有所提高，培養(yǎng)條件只需用DMEM培養(yǎng)基加新生牛血清、置恒溫電熱培養(yǎng)箱即可。

圖1 分離毒株在接種LMH細(xì)胞、Vero細(xì)胞、QT35細(xì)胞48h 細(xì)胞病變情況(100×) A．正常的LMH細(xì)胞；B.病毒感染的LMH細(xì)胞；C.正常的Vero細(xì)胞；D.病毒感染的Vero細(xì)胞； E.正常的QT35細(xì)胞；F.病毒感染的QT35細(xì)胞Fig. 1 Cytopathic condition of isolated virus strains inoculated with LMH cells, Vero cells and QT35 cells at 48h (100X) A. Normal LMH cells; B. Virus-infected LMH cells; C. Normal Vero cells; D. Virus-infected Vero cells; E. Normal QT35 cells; F. Virus-infected QT35 cells

2.3 FADV-4濱州株在LMH細(xì)胞上培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 不同接毒劑量對TCID50的影響結(jié)果 分別按接毒量為1/100、1/200、1/400、1/800、1/1000接種LMH細(xì)胞，于接毒后細(xì)胞病變達(dá)到約85%時收獲病毒液，測定TCID50。結(jié)果表明，最佳接毒量為1/1000(圖2)。

2.3.2 不同吸附時間對TCID50的影響結(jié)果 接種病毒后吸附1 h組的平均病毒含量可達(dá)108.125TCID50/0.1 mL。接毒后吸附0 h、0.5 h、1.5 h、2 h組的平均病毒含量均低于吸附1 h組的平均病毒含量，所以接毒后最佳吸附時間為1 h(見圖2)。

2.3.3 不同收獲時間對TCID50的影響結(jié)果 當(dāng)接種后36 h收獲時病毒的毒價最高，平均值達(dá)到108.27/0.1 mL。24 h和48 h收獲時病毒毒價均低于36 h收獲時病毒毒價，由此確定該分離毒株的最佳收獲時間為接種后36 h(見圖2)。

圖2 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization of culture conditions

3 討 論

一直以來，如何快速、高效的增殖病毒是疫苗研發(fā)生產(chǎn)中必須考慮的基本問題之一。由于傳統(tǒng)方式不能滿足需求，利用各類細(xì)胞增殖病毒成為疫苗研究者們關(guān)注的領(lǐng)域。細(xì)胞系生產(chǎn)疫苗具有生產(chǎn)成本低、操作簡單、對免疫動物機(jī)體副反應(yīng)小等特點(diǎn)，最重要的是能克服SPF雞胚存在的缺點(diǎn)，避免了雞源性潛在疾病的感染。FAdV-I一般不感染異種動物，在其相應(yīng)的細(xì)胞中生存繁殖不佳，因此采用禽源的細(xì)胞來培養(yǎng)本病毒效果最好，如雞胚或是雛雞腎細(xì)胞、雞胚或是雛雞肝細(xì)胞或者雞胚等。病毒感染的細(xì)胞一般會表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞病變：細(xì)胞變圓成葡萄狀、折光性變強(qiáng)，最后細(xì)胞脫落[12]。本試驗(yàn)選取了DF-1細(xì)胞、LMH細(xì)胞、Vero細(xì)胞、QT-35細(xì)胞培養(yǎng)FADV-4濱州株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株在DF-1細(xì)胞上盲傳三代無細(xì)胞病變可見，在LMH細(xì)胞、Vero細(xì)胞、QT-35細(xì)胞上均能看到明顯的細(xì)胞病變。通過傳代培養(yǎng)、CPE觀察及病毒含量測定，最終篩選出CPE明顯，病毒含量高的病毒適應(yīng)性細(xì)胞-LMH細(xì)胞。LMH細(xì)胞作為永生化細(xì)胞系，是通過化學(xué)藥物誘導(dǎo)正常細(xì)胞而建立的細(xì)胞系，不含任何外源病毒和致瘤基因，可以無限傳代，作為滅活疫苗的生產(chǎn)是安全的[13]。

本研究通過對LMH細(xì)胞進(jìn)行克隆篩選及病毒培養(yǎng)特性研究，結(jié)果證明了雞源禽腺病毒可在LMH細(xì)胞上有效增殖并形成腺病毒特征性細(xì)胞病變，病毒含量最高可達(dá)到108.375TCID50/0.1 mL趙蕾等[14]研究證明FADV DC株在LMH細(xì)胞上增殖時，病毒含量可達(dá)107.5TCID50/0.1 mL。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。LMH細(xì)胞系屬于肝上皮細(xì)胞，而腺病毒傾向于感染上皮細(xì)胞，這可能與上皮細(xì)胞表達(dá)較高水平病毒受體有關(guān)。由于不同的毒株對不同的細(xì)胞感染能力不一樣，所以在具體實(shí)驗(yàn)中需要摸索病毒的最佳增殖條件。

4 結(jié) 論

本研究通過克隆篩選、優(yōu)化培養(yǎng)，獲得一株易培養(yǎng)的LMH細(xì)胞，并且該細(xì)胞最適宜雞源4性禽腺病毒濱州株的培養(yǎng)，建立了禽腺病毒4型的細(xì)胞培養(yǎng)模型。該毒株的最佳增殖條件為:最佳接毒量為1/1000、接毒后最佳吸附時間為1 h、收毒時間為接毒后36 h。該研究為雞源禽腺病毒的分離、疫苗研究及疾病防控提供參考。