郭曉飛，豐雨琪，張金龍，李義海，董春曉，張效生(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，天津市畜禽健康養(yǎng)殖工程中心，天津 300381)

肉類消費市場對畜牧業(yè)生產(chǎn)力提升的需求日益迫切，人們對家畜、家禽的肉、奶、蛋和毛皮等性狀進(jìn)行選育與改進(jìn)。然而，對于一些體型稍大的家畜(如牛、羊、豬等)，其生殖周期、世代間隔等繁殖特點很大程度上阻礙了育種學(xué)家們的快速選育與種質(zhì)改進(jìn)步伐。包括人工授精、同期發(fā)情、超數(shù)排卵和胚胎移植等在內(nèi)的輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology, ART)可以幫助育種學(xué)家們突破家畜的自然生殖規(guī)律(如季節(jié)性發(fā)情、發(fā)情不集中等)，極大地提高優(yōu)秀個體的繁育能力，更好的保留和選育優(yōu)良遺傳性狀[1]。

幼畜體外胚胎移植(Juvenile in Vitro Embryo Transfer, JIVET)技術(shù)即是ART的一種。雖然幼齡母畜其性腺生殖系統(tǒng)還未充分發(fā)育完全，但其原始生殖細(xì)胞已經(jīng)存在于卵巢內(nèi)，且幼畜機體對外源生殖激素的反應(yīng)較之成年母畜更加敏感；因而，當(dāng)利用幼畜進(jìn)行超數(shù)排卵時，可產(chǎn)生數(shù)量遠(yuǎn)高于成年母畜的竇狀卵泡[2]。經(jīng)體外成熟培養(yǎng)和受精后，可大量生產(chǎn)胚胎；移植至成年代孕母畜子宮內(nèi)，能迅速獲得數(shù)量眾多的后代個體[3]。

1 幼畜超數(shù)排卵的生理基礎(chǔ)

卵巢起源于腎臟器官或中腎的內(nèi)側(cè)。隨著胚胎的發(fā)育，原始生殖細(xì)胞繼續(xù)通過有絲分裂進(jìn)行增殖；然而，由于細(xì)胞凋亡的發(fā)生，在胎兒出生前原始生殖細(xì)胞數(shù)量即出現(xiàn)急劇減少[4]。研究表明，在有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)闇p數(shù)分裂時，原始生殖細(xì)胞的數(shù)量可達(dá)到最大值[4]。在人類中，原始生殖細(xì)胞最大值時間為胎兒發(fā)育的第五個月，約有7×106個原始生殖細(xì)胞，而到達(dá)出生時只有2×106個仍然存活[5]。小母牛出生前原始生殖細(xì)胞最大數(shù)量可達(dá)2.1×106個，但出生時卻僅剩1.3×105個[6]。犢牛在其妊娠約第140天時，原始卵泡開始形成、卵泡募集自此立即開始，并且持續(xù)不斷地直至耗盡卵巢所有原始生殖細(xì)胞，約至妊娠第230天可以識別出卵巢上的第一個竇狀卵泡[4]。

出生4～8周后的羔羊，其卵巢重量是其剛出生時的6～8倍，而之后的12～33周的卵巢質(zhì)量卻顯著下降；且竇狀卵泡由出生時的(935±208)個增加至4周齡的(1100±185)個，而12周齡的竇狀卵泡急劇下降至(287±99)個[7]。Tassell等[8]指出4周齡羔羊卵巢竇狀卵泡出現(xiàn)明顯的閉鎖現(xiàn)象，并在8～10周齡時卵巢上的閉鎖卵泡數(shù)量繼續(xù)增加。在性成熟后，竇狀卵泡可在促性腺激素的刺激下繼續(xù)發(fā)育、排卵，從而避免了閉鎖的命運。然而，在8周齡前，羔羊垂體和血漿中的促卵泡生成素(FSH)和促黃體生成素(LH)的濃度較低，且隨著周齡的增加未能表現(xiàn)出顯著提升；同時，卵巢所分泌的孕酮和雌二醇與其卵泡發(fā)育無顯著關(guān)聯(lián)[8]。該周齡階段的卵巢內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機制雖不健全，但其對促性腺激素的刺激較為敏感[3]。通過補充外源促性腺激素，可使這一時期即將閉鎖的卵泡迅速發(fā)育，并能獲得比成年母畜更可觀的超排效果。如Morton等[9]以3～6周齡羔羊為處理對象，使用苯甲酸雌二醇、孕酮栓塞、PMSG和FSH組成的外源激素用藥方案，可使羔羊卵巢在外科腹部手術(shù)條件下，收集大量卵泡(118.2±29.2)和卵母細(xì)胞(82.0 ±24.2)。此外，為評估外源激素和外科手術(shù)處理對羔羊青春期發(fā)情啟動和繁殖力的影響，Valasi等[10]利用1月齡的羔羊，經(jīng)每月一次的激素刺激和外科手術(shù)操作(4個月內(nèi)，4次腹腔鏡法收集卵母細(xì)胞)，得出幼年期的激素和手術(shù)處理對羔羊后期的內(nèi)分泌和生殖狀態(tài)并未造成明顯傷害。Currin等[11]以2～6月齡的犢牛為研究對象，也證實了多次(4個月內(nèi)，8次腹腔鏡法收集卵母細(xì)胞)超數(shù)排卵以及卵母細(xì)胞收集對犢牛是安全可控的，且成年后可正常懷孕繁殖。

2 幼畜的超數(shù)排卵效果及優(yōu)化方案

幼畜超數(shù)排卵的激素給藥方案基本是根據(jù)成年母羊的促性腺激素刺激方案(多次注射FSH或者單次注射eCG)而制定的。由于羔羊體重偏小，其比成年母羊所接受促性腺激素的劑量也會更少。Valasi等[12]指出，依據(jù)羔羊體重調(diào)節(jié)FSH注射劑量(0.27 mg/kg)所獲得卵母細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量明顯優(yōu)于統(tǒng)一FSH注射劑量(3.52 mg /羔羊)。Fang等[13]通過在羔羊左耳皮下埋置18 mg褪黑激素緩釋后，再進(jìn)行超數(shù)排卵(FSH/12h×2d+PMSG)時發(fā)現(xiàn)，與對照組相比可明顯提高>2 mm直徑卵泡數(shù)量(106±14.9_VS_79.4±9.22)和卵母細(xì)胞數(shù)量(86.3±7.77_VS_55.2±4.29)。Currin等[11]在犢牛超數(shù)排卵研究中，認(rèn)為72 h長時效FSH刺激方案(6次×12 h間隔)所獲得的>5 mm直徑卵泡比率(34.0%_VS_11.2%)、優(yōu)質(zhì)卵丘-卵母細(xì)胞(CoCs)比率(95.3±18%_VS_ 85.4±22%)和囊胚率(36.7±26%_VS_18.3±15%)均顯著優(yōu)于36 h短時效刺激方案(3次×12 h間隔)。

除了激素刺激方案的差別，幼齡動物的日齡也是影響其超數(shù)排卵效果的重要因素。Valasi等[12]采用相同的激素處理方案(2×P4+FSH/12 h×3 d)指出：2月齡和5月齡羔羊供體的卵母細(xì)胞成熟能力相近，但3至4月齡的羔羊供體的卵母細(xì)胞成熟能力非常差。Mao等[14]采用PMSG處理后得出，5～8周齡的羔羊超數(shù)排卵后，其可獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量(108. 50±17. 68)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于10周齡羔羊(42.0±11.3)。Baldassarre等[15]利用FSH配合eCG處理方案刺激青春期前的山羊時，發(fā)現(xiàn)60～90日齡的山羊供體，超排后可獲得卵母細(xì)胞數(shù)量為(49.7±24)個，極顯著高于90～150日齡山羊供體所能提供的(34.4±20)個卵母細(xì)胞數(shù)量。

青春期前幼畜對超排激素的敏感性還存在著巨大的個體差異，目前已報道的數(shù)據(jù)顯示，約有27%～72%的羔羊個體對超排激素的應(yīng)答效果不甚理想(低于5個卵泡)[16]。因此，若能提前預(yù)知羔羊卵巢的超排反應(yīng)效果，不僅關(guān)系到動物福利，也可避免不必要的手術(shù)傷害。Valasi等[17]提出，根據(jù)手術(shù)收集卵母細(xì)胞前12 h的雌二醇濃度，可以協(xié)助排除超排效果較差(≤1個卵泡)和中等(2～5個卵泡)的羔羊個體，并據(jù)此可避免對低敏感羔羊的重復(fù)手術(shù)和激素處理。

不論何種激素處理方案，青春期前幼畜卵母細(xì)胞體外發(fā)育的能力均比成年動物低。相比于成年母畜，幼年母畜超排后卵泡內(nèi)的卵泡液微環(huán)境、卵丘細(xì)胞狀態(tài)、卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核成熟等各方面的均有所差異 。

3 幼畜與成年卵母細(xì)胞體外成熟比較

3.1 幼畜與成年卵泡液微環(huán)境的比較

卵泡液的主要成分包括碳水化合物、脂肪酸、多肽、激素和生長因子等，是卵母細(xì)胞在體內(nèi)生長和成熟的主要微環(huán)境[18-19]。雖然，尚不完全了解卵泡液中的各個成分能在多大程度上影響卵母細(xì)胞的成熟過程；但已有研究表明，幼年和成年母畜中卵泡液的組成差異較大[20-23]。比如，青春期前犢牛卵泡液所含葡萄糖和脂肪滴等的濃度要顯著低于成年母牛[20，22]。在綿羊中，Wu等[23]通過iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有243種蛋白質(zhì)在1月齡羔羊與成年母羊卵泡液中差異表達(dá)。上述幼齡和成年母畜卵泡液微環(huán)境的差異，可能部分解釋了幼畜卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育能力低的原因。

Tian等[24]報道，在羔羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中添加成年母羊的卵泡液，可改善羔羊卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎的囊胚率。但在成年卵母細(xì)胞成熟過程中添加其卵泡液，囊胚率并未得到顯著提升，即成年母羊卵泡液中可能包含羔羊卵泡液所不存在的重要刺激因子，并且羔羊卵母細(xì)胞對這些刺激因子能做出有效應(yīng)答。Pawlak等[25]在仔豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基中添加成年母豬的卵泡液時，結(jié)果也具有提高囊胚率的相似功效。但是，成年母畜卵母細(xì)胞體外成熟過程中，不論是否添加了任何來源的卵泡液，其成熟過程似乎不受影響；即成年母畜卵母細(xì)胞在其相應(yīng)卵泡中可能已經(jīng)達(dá)到了完整的發(fā)育能力，從而在體外培養(yǎng)過程中對常規(guī)培養(yǎng)基的要求不再苛刻。

3.2 幼畜與成年的卵丘細(xì)胞差異

卵丘細(xì)胞是通過精巧的間隙連接以參與卵母細(xì)胞成熟過程的[26]。卵丘細(xì)胞的主要作用表現(xiàn)在：(1)可使卵母細(xì)胞維持在減數(shù)分裂停滯狀態(tài)，(2)參與誘導(dǎo)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，(3)為卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟提供條件。Haenisch-Woehl等曾在光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，與成年犬相比，青春期前的犬卵丘細(xì)胞的細(xì)胞核凸顯，并只擁有很少量的細(xì)胞質(zhì)[37]。Fang等[13]通過皮下埋置褪黑激素再進(jìn)行羔羊超數(shù)排卵時發(fā)現(xiàn)，凋亡性卵丘細(xì)胞比例更低、卵丘細(xì)胞的DNA甲基化染色信號更強。Fang等[28]再次報道了褪黑激素可上調(diào)卵丘細(xì)胞上的核結(jié)合位點基因RORα、抗氧化相關(guān)基因(SOD1、GPx4、CAT)和與卵丘細(xì)胞擴張相關(guān)基因(PTX3、HAS2、PTGS2)等的mRNA表達(dá)水平，并能顯著降低卵丘細(xì)胞的氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞的凋亡。綜上，羔羊卵母細(xì)胞外圍的卵丘細(xì)胞擴張率、凋亡率、氧化應(yīng)激狀態(tài)及相關(guān)基因表達(dá)水平，可以作為衡量羔羊卵母細(xì)胞體外成熟的重要指標(biāo)。

3.3 細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核成熟

在小鼠的研究中，Eppig等[29]發(fā)現(xiàn)隨著卵母細(xì)胞直徑從65 μm增加到80 μm，其正常發(fā)育和成熟的能力逐步提高；即卵母細(xì)胞生長的最后階段發(fā)生的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核變化對于卵母細(xì)胞最后成熟至關(guān)重要。通過核移植等試驗研究表明，小鼠的卵母細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟均在此階段發(fā)揮了重要作用[16，30]。因此，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核成熟一度成為幼畜卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究熱點。

21世紀(jì)前，關(guān)于幼齡反芻動物卵母細(xì)胞生產(chǎn)的胚胎發(fā)育停滯問題，學(xué)者們多數(shù)歸因于其卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)各方面的缺陷或不成熟[31-33]。上述推測主要考慮到，青春期前的犢牛和羔羊卵母細(xì)胞直徑通常比成年母畜的卵母細(xì)胞直徑小[34]。Anguita等[35]在青春期山羊研究中也顯示，卵母細(xì)胞發(fā)育能力與卵母細(xì)胞直徑和卵母細(xì)胞形態(tài)密切相關(guān)。在超微結(jié)構(gòu)觀察中，成年母豬卵母細(xì)胞成熟后，表現(xiàn)為MⅡ期的正常到來、卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞接觸的缺失、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的消失以及線粒體和脂滴排列位置的集中化；而至于青春期前的仔豬卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上的情況則多種多樣。較大體積的仔豬卵母細(xì)胞與成年母豬卵母細(xì)胞差異相對較少，但較小體積的仔豬卵母細(xì)胞其超微結(jié)構(gòu)上的線粒體總數(shù)明顯較少(線粒體密度基本一致)，且分布位置更加彌散。Pedersen等[36]由此認(rèn)為，卵母細(xì)胞質(zhì)中的線粒體數(shù)量決定了青春期前仔豬卵母細(xì)胞的體外成熟能力。

線粒體作為細(xì)胞質(zhì)能量供應(yīng)來源的主要細(xì)胞器，已被證明與卵母細(xì)胞發(fā)育能力息息相關(guān)，其數(shù)量和功能狀態(tài)可影響受精過程和胚胎發(fā)育[37-39]。尤其表現(xiàn)在卵母細(xì)胞成熟過程中，線粒體合成的ATP對于蛋白質(zhì)合成和磷酸化修飾的重要作用[40]。Leoni等[41]指出羔羊(30～40日齡)卵母細(xì)胞成熟至MⅠ期的時間比成年母羊卵母細(xì)胞晚1小時，其細(xì)胞內(nèi)ATP增長時間被延遲且未達(dá)到成年卵母細(xì)胞水平；共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示MⅡ期的羔羊卵母細(xì)胞具有活性的線粒體是均勻分布的，相反，成年卵母細(xì)胞是聚集成簇出現(xiàn)的。Leoni等[42]還報道羔羊卵母細(xì)胞質(zhì)中有7個基因(Na+K+ATPase、p34cdc2、Glut-1、Activin、PanZO2、PAP和E-Cad)的mRNA表達(dá)量豐度顯著低于成年卵母細(xì)胞。

卵母細(xì)胞質(zhì)中的微管對于其減數(shù)分裂至關(guān)重要，它參與減數(shù)分裂紡錘體的形成和染色體的運動，并且其生理作用受到翻譯后修飾的調(diào)控。Serra等[43]通過熒光染色研究了青春期前羔羊和成年母羊體外成熟過程中的微管翻譯后修飾，發(fā)現(xiàn)成年母羊卵母細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白乙?；屠野彼峄较喈?dāng)；而在羔羊卵母細(xì)胞中，微管蛋白乙酰化水平卻顯著高于酪氨酸化水平。這一結(jié)果暗示著，相較與成年卵母細(xì)胞，處于MⅡ期的羔羊卵母細(xì)胞的微管惰性更強，不利于紡錘體活躍與染色體的拖動 。

在卵泡生成的過程中，卵母細(xì)胞逐漸獲得了減數(shù)分裂的能力，伴隨著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞核內(nèi)基因的表達(dá)沉默調(diào)控；特定啟動子區(qū)域的局部染色質(zhì)修飾和單拷貝基因的順式作用調(diào)控元件，以及整個基因組大規(guī)模的染色質(zhì)重塑，均在這一過程中發(fā)揮重要作用[44-45]。核內(nèi)DNA甲基化是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體進(jìn)行正確配對的前提條件，且表觀遺傳成熟也是卵母細(xì)胞獲得減數(shù)分裂及其后續(xù)發(fā)育潛能的重要標(biāo)志[46-48]。Ptak等[16]還發(fā)現(xiàn)來自羔羊卵母細(xì)胞胚胎的發(fā)育停滯發(fā)生率很高，進(jìn)一步檢測顯示其卵母細(xì)胞全基因組甲基化也較低。Fang等[49]通過比較4周齡羔羊和2.5歲成年母羊的超數(shù)排卵和體外胚胎生產(chǎn)研究發(fā)現(xiàn)，羔羊卵母細(xì)胞成熟率(77.97% vs 92.16%)和胚胎卵裂率(59.19% vs 82.98%)均大大低于成年母羊。隨著卵母細(xì)胞的體外成熟與受精，不論其來自羔羊還是成年母羊，細(xì)胞核DNA的5mC和5hmC染色信號均逐漸增強，即胚胎的形成和發(fā)育伴隨著DNA甲基化水平的加強；但相比于成年母羊，羔羊卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育各個階段的5mC和5hmC的染色信號強度均更低，且各階段的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmt1，Dnmt3a和Tet3)mRNA的表達(dá)水平也表現(xiàn)為羔羊顯著低于成年母羊。據(jù)此推測，較少的甲基轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致的低DNA甲基化水平，可能引起羔羊卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育潛能的降低。而Cocero等[45]從較大月齡的羔羊(3月齡)和成年母羊卵巢表面直徑大于3mm的竇狀卵泡中獲取GV期卵母細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)兩類卵母細(xì)胞GV期DNA甲基化水平以及二者的成熟能力相當(dāng)，但在最終胚胎囊胚率指標(biāo)上，3月齡羔羊來源的卵母細(xì)胞仍然顯著低于成年卵母細(xì)胞。綜上所述，細(xì)胞質(zhì)成熟和細(xì)胞核成熟均參與了幼畜卵母細(xì)胞的體外成熟過程。

4 幼畜卵母細(xì)胞體外成熟方案的優(yōu)化

目前，用于幼畜卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)基基本與成年母畜的一致；但幼畜卵母細(xì)胞體外生產(chǎn)的胚胎發(fā)育能力要顯著低于成年母畜，這表明傳統(tǒng)的體外成熟液并不完全適應(yīng)于幼畜卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)以及隨后的胚胎發(fā)育[24]。Byskov等[50]曾在人類卵泡液中分離出一種可促使小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的固醇類物質(zhì)，被稱為卵泡液減數(shù)分裂激活固醇(FF-MAS)。經(jīng)研究，AY9944 A-7可通過抑制Δ14還原酶的活性來誘導(dǎo)FF-MAS的積累[51]。因此，Hao等[52]通過在體外培養(yǎng)基中添加AY9944 A-7來改善羔羊卵母細(xì)胞培養(yǎng)條件，結(jié)果顯示AY9944 A-7不僅可以促進(jìn)自然狀態(tài)下的羔羊卵母細(xì)胞成熟，同時還可以改善次黃嘌呤抑制下的卵母細(xì)胞成熟，并對二細(xì)胞期發(fā)育至囊胚期也有提升作用。

還原型谷胱甘肽(GSH)在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中可保護(hù)其免受氧化損傷、參與減數(shù)分裂紡錘體形成和染色質(zhì)的縮聚。據(jù)報道，伴隨著卵母細(xì)胞成熟，細(xì)胞中GSH含量也隨之增加；且體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞比體外成熟的卵母細(xì)胞含有更多的GSH[53]。Kochhar等[54]通過蛋白放射標(biāo)記顯示，相比于羔羊而言，成年卵母細(xì)胞中含有更高濃度的蛋氨酸和半胱氨酸(合成GSH的重要蛋白質(zhì))。Bai等[53]通過在體外培養(yǎng)基中添加2-巰基乙醇和半胱氨酸來增加培養(yǎng)體系中的GSH濃度，結(jié)果并未提高羔羊卵母細(xì)胞的成熟率，即來源于自身成熟過程中的GSH積累才是體外培養(yǎng)及后續(xù)受精和胚胎發(fā)育的關(guān)鍵；但其所添加的2-巰基乙醇和半胱氨酸可改善精子的染色質(zhì)解凝和原核形成，從而一定程度上提高了卵母細(xì)胞受精率。de Matos等[55]以PMSG處理成年(8周齡)和青春期前小鼠(24～26日齡)，并在48 h后從卵巢中取出卵母細(xì)胞用于體外胚胎生產(chǎn)；與對照組相比，添加半胱氨酸鹽組的成年小鼠來源胚胎發(fā)育均能得到改善，但并不能改善青春期前的小鼠來源胚胎。由此推測，青春期前卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(CoCs)在谷胱甘肽合成能力方面存在的不足，也可能成為導(dǎo)致體外胚胎生產(chǎn)效果不佳的原因。

乙?；笮鈮A參與線粒體中的脂肪酸氧化和能量代謝，可運輸游離脂肪酸至線粒體內(nèi)膜上，能調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激并參與細(xì)胞凋亡等重要細(xì)胞活動[56]。在小鼠、豬和牛的卵母細(xì)胞體外成熟研究中表明，添加左旋肉堿可有效提高體外胚胎卵裂率或囊胚率[57-58]。Reader等[59]在體外培養(yǎng)羔羊卵母細(xì)胞添加乙?；笮鈮A后，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞質(zhì)和生發(fā)泡體積顯著增大，且改變了卵母細(xì)胞的脂滴分布，最終使囊胚率由4.6%增加至10.0%。褪黑激素作為抗氧化物質(zhì)除自身可清除機體的ROS外，還能刺激某些抗氧化酶的活性，以降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。Fang等[28，60-61]和Soto-Heras等分別以幼年綿羊和山羊為研究對象，篩選出添加10-7濃度的褪黑激素可有效清除卵母細(xì)胞ROS水平，增加了卵母細(xì)胞的線粒體活性和ATP含量，提高了卵丘細(xì)胞的擴張率、降低了卵丘細(xì)胞的凋亡率。

考慮到來自同一幼畜的卵母細(xì)胞的質(zhì)量可能是高度異質(zhì)的，不同幼畜個體中獲取的卵母細(xì)胞狀態(tài)也可能不一致。研究者們認(rèn)為，通過藥物暫時性阻斷卵母細(xì)胞自發(fā)性核成熟，在體外延長減數(shù)分裂可改善核成熟與胞質(zhì)成熟之間的同步性[62-65]。這樣可保證卵母細(xì)胞有充足時間經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和生理變化，并有助于處于不同階段GV期的卵母細(xì)胞同步化，從而改善卵母細(xì)胞體外成熟效率。如Wang等[65]研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過13 μM亮甲酚藍(lán)著色后的羔羊來源的卵母細(xì)胞囊胚率顯著高于未著色組(37.03%_VS_6.28%)；未著色組中，在體外成熟液中添加75 μM濃度甲氰吡酮，處理6 h后可有效改善后續(xù)的囊胚率。分析認(rèn)為，甲氰吡酮一定程度上抑制卵母細(xì)胞發(fā)育，致使卵內(nèi)cAMP水平累積保持卵母細(xì)胞停滯在GV期；最終為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)同時成熟提供合適的條件。

5 總 結(jié)

相比于成年母畜，幼年母畜卵巢具備提供更多卵母細(xì)胞的生理基礎(chǔ)與潛能。然而，幼畜來源卵母細(xì)胞在后續(xù)體外成熟、胚胎卵裂率和囊胚率方面表現(xiàn)不佳。綜合已有報道顯示，卵泡液微環(huán)境、卵丘細(xì)胞氧化應(yīng)激或凋亡情況、卵母細(xì)胞體積、線粒體數(shù)量和微管蛋白修飾以及細(xì)胞核內(nèi)DNA甲基化水平等均能影響幼畜卵母細(xì)胞的發(fā)育競爭能力。結(jié)合以上因素及目前體外成熟優(yōu)化方案研究進(jìn)展，凡有助于CoCs內(nèi)GSH合成、線粒體氧化應(yīng)激緩解、胞質(zhì)和核內(nèi)成熟物質(zhì)積累的添加物，均有可能改善現(xiàn)有的幼畜卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)。