陳蓉 范麗麗 盧佳如 祁靜 申迎賓

摘 要：目的：通過研究枇杷葉提取液消化前后對腸道益生菌的生長和代謝產(chǎn)生的影響，以及在消化過程中對消化酶活力的影響來探討枇杷葉提取液的降血糖作用。方法：通過體外試驗(yàn)，考察了不同濃度的枇杷葉提取液對3種益生菌的增殖作用及對腸道消化酶的活性影響，并探討了枇杷葉提取液經(jīng)消化酶消化后對腸道益生菌的增殖作用。結(jié)果：（1）一定濃度的枇杷葉提取液對單獨(dú)培養(yǎng)的雙歧桿菌有顯著的促進(jìn)作用，但其對嗜酸乳桿菌的生長代謝無顯著影響。（2）枇杷葉提取液經(jīng)消化酶作用后對腸道益生菌的促生作用顯著降低，甚至表現(xiàn)出抑制作用。（3）試驗(yàn)組代謝產(chǎn)物中的丙酸含量要明顯高于對照組，而其他兩種酸的含量差別并不顯著。（4）濃度為6 g/L的枇杷葉提取液對蛋白酶活力的促進(jìn)作用最為顯著，而所研究的不同濃度枇杷葉提取液對胰淀粉酶活力均表現(xiàn)出抑制作用，對胰脂肪酶的活力無顯著影響。結(jié)論：枇杷葉提取液可能是通過降低淀粉酶的活性及通過增加益生菌代謝產(chǎn)物中的丙酸含量來達(dá)到降低血糖濃度的目的。

關(guān)鍵詞：枇杷葉;腸道益生菌;消化酶;模擬消化;降血糖

枇杷葉是薔薇科枇杷（Eriobotrya japonica）的干葉，在中國主要分布在江蘇、安徽、江西、福建、四川、云南等地。枇杷葉中的主要功能物質(zhì)為黃酮類、三萜酸類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類等，具有抗炎、祛痰、止咳、抗肺纖維化、抗氧化、降血糖、抗腫瘤、抗惡心等藥理作用[1]。目前，關(guān)于枇杷葉止咳平喘、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用的研究以及降血糖的研究已有不少[2-7]，但從調(diào)節(jié)腸道菌群的角度來探討枇杷葉降血糖的作用研究卻未見報(bào)道。石學(xué)魁等[8]研究表明，枇杷葉水煎液能使鹽酸可霉素灌服導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)小鼠模型中腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量恢復(fù)到正常范圍，說明其具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。枇杷葉富含的黃酮類和三萜類成分是良好的降血糖、抗肥胖的活性成分[9]，具有較高的開發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

腸道益生菌主要有四大類，即雙歧桿菌、乳桿菌、球菌和芽孢桿菌，具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[10]、提高機(jī)體免疫力[11]等多種功能。相關(guān)研究表明，益生菌能夠改善胃腸道粘膜的微生態(tài)或酶的平衡，從而達(dá)到提高機(jī)體免疫力的作用[12]。本研究探討了枇杷葉提取液對腸道益生菌繁殖代謝和腸道消化酶的作用，可為枇杷葉的降血糖作用研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要儀器 759S紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司;潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BM1800雙目顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;生化恒溫箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;生化恒溫箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司;電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌種 青春雙歧桿菌BNCC134301（Bifidoba-cterium adolescentis）、兩歧雙歧桿菌BNCC186304（Bifido-bacterium bifidum）、嗜酸乳桿菌BNCC185342（Lactobacillus acidophilus），均由BNCC蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制 MRS培養(yǎng)基（嗜酸乳桿菌）：5.00 g酪蛋白胨、1.00 g檸檬酸三胺、0.10 g七水硫酸鎂、1.00 g磷酸氫二鉀、10.00 g葡萄糖、2.88 g酵母膏、5.75 g牛肉膏、0.03 g硫酸錳、2.50 g乙酸鈉、0.50 g吐溫80，加蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至6.0～6.4，然后用蒸餾水定容至500 mL。于121 ℃下高壓滅菌20 min，放至室溫后于4 ℃冰箱中儲(chǔ)藏。

BBL培養(yǎng)基（雙歧桿菌）：2.50 g氯化鈉、7.50 g大豆蛋白胨、0.10 g七水硫酸鎂、1.00 g磷酸氫二鉀、10.00 g葡萄糖、14.40 g酵母膏、0.25 g可溶性淀粉、0.03 g硫酸錳、1.00 g檸檬酸氫二胺、0.25 g L-半胱氨酸、1.00 g吐溫80，加蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0，然后定容至500 mL容量瓶中。轉(zhuǎn)移至三角瓶中并于121 ℃下高壓滅菌20 min，放置至室溫后于4 ℃冰箱中儲(chǔ)藏。

混合培養(yǎng)基（混合菌）：2.50 g氯化鈉、7.50 g大豆蛋白胨、0.10 g七水硫酸鎂、1.00 g磷酸氫二鉀、10.00 g葡萄糖、14.40 g酵母膏、0.25 g可溶性淀粉、0.03 g硫酸錳、1.00 g檸檬酸氫二銨、0.25 g L-半胱氨酸、1.00 g吐溫80、5.00 g酪蛋白胨、5.75 g牛肉膏、1.00 g檸檬酸銨、2.50 g乙酸鈉，加蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0，最后定容至500 mL容量瓶中。轉(zhuǎn)移至三角瓶中并于121 ℃下高壓滅菌15 min，放置至室溫后于4 ℃冰箱中儲(chǔ)藏。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基的配制 選擇對益生菌促生作用最顯著的枇杷葉濃度來配制增殖培養(yǎng)基，以最適濃度的枇杷葉提取液來溶解相應(yīng)試劑配制的培養(yǎng)基即為增殖培養(yǎng)基。

1.2.3 消化液培養(yǎng)基的配制 胃腸消化液的配置根據(jù)Alvito等[1]報(bào)道的研究方法稍加修改，具體配置方法及步驟：（1）模擬胃液電解質(zhì)溶液（SGF）及腸液電解質(zhì)溶液（SIF）的配制：分別配制濃度為0.5 mol/L的KCl溶液、0.5 mol/L 的KH2PO4溶液、1 mol/L 的NaHC03溶液、2 mol/L 的NaCl溶液、0.15 mol/L 的MgCl2（H2O）6溶液、0.5 mol/L 的（NH4）2CO3溶液。SGF的配制分別按順序加入上述溶液6.9、0.9、12.5、11.8、0.4、0.5 mL，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至3.0，加蒸餾水配制成500 mL溶液，然后在-20 ℃下儲(chǔ)存。SIF的配制分別按順序加入上述溶液6.8、0.8、42.5、9.6、1.1 mL，然后用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，加蒸餾水配制成500 mL溶液，于-20 ℃下儲(chǔ)存。

（2）模擬胃消化：取100 mL一定濃度的枇杷葉提取液與76 mL SGF混合，加入4 mL胃蛋白酶（2 000 U/mL，用SGF配制）及無水氯化鈣（最終濃度為0.075 mmol/L），加入1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至3.0，最后加水至200 mL，在37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中消化2 h。

（3）模擬腸消化：200 mL胃消化液與152 mL SIF混合，加入8 mL胰酶（胰蛋白酶100 U/mL、胰脂肪酶2 000 U/mL、胰淀粉酶200 U/mL，均使用SIF配制），加入4 g膽鹽及無水氯化鈣（最終濃度為0.3 mmol/L），加入1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，最后加水至400 mL，在37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中消化2 h。

（4）配制BBL消化液培養(yǎng)基及MRS消化液培養(yǎng)基：稱取相應(yīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的試劑后，用上述經(jīng)消化后的消化液將所有試劑溶解，然后分別調(diào)節(jié)pH至7.0及6.2～6.4，于121 ℃下高壓滅菌15 min，放置至室溫后儲(chǔ)藏于4 ℃冰箱。

1.2.4 活化菌種 在超凈工作臺(tái)上將益生菌凍干粉用少量生理鹽水溶解，充分振蕩使菌體分散均勻，以涂布的方式接種于2個(gè)10 mL固體培養(yǎng)基上，在37 ℃下，用厭氧袋培養(yǎng)48 h，傳代2次，挑取一部分單菌落與50%的甘油混合放置于5 mL離心管中，于-80 ℃下凍存。

1.2.5 測定生長曲線 在10 mL試管中準(zhǔn)確加入12 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基排盡試管內(nèi)空氣，接入1 mL菌液，塞上試管塞，并用保鮮膜裹嚴(yán)試管口，放入37 ℃生化恒溫箱中厭氧培養(yǎng)24 h，分別于0 h、2 h、4 h、……、24 h（每隔2 h）時(shí)在690 nm下測定吸光度，以空白培養(yǎng)基調(diào)零。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定3組平行。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.2.6 枇杷葉對益生菌的增殖作用（1）枇杷葉提取液的制備：稱取50.0 g枇杷葉，用1 000 mL蒸餾水浸泡30 min后大火煮沸，保持微沸狀態(tài)20 min，經(jīng)四層紗布過濾，重復(fù)煮兩次，合并兩次藥液。放置至室溫后定容到1 000 mL容量瓶中，配制成濃度為50 g/L的枇杷葉提取液，分別取一定量該濃度的枇杷葉提取液制備一系列濃度梯度為1～20 g/L的藥液250 mL。

（2）藥液培養(yǎng)基的制備：BBL藥液培養(yǎng)基：按照其基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成稱取相應(yīng)試劑，分別用濃度為8～17 g/L的枇杷葉提取液溶解并定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，于121 ℃下高壓滅菌20 min，放置至室溫后于4 ℃冰箱中儲(chǔ)藏。MRS藥液培養(yǎng)基：按照其基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方稱取相應(yīng)試劑，分別用濃度為1～10 g/L的枇杷葉提取液溶解后定容到500 mL，調(diào)節(jié)pH到6.0～6.4，于121 ℃下滅菌20 min，放置至室溫后于4 ℃冰箱中儲(chǔ)藏。

（3）不同濃度枇杷葉提取液對菌種生長的影響：①對照組：在10 mL試管中準(zhǔn)確加入12 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基以排盡試管內(nèi)空氣，接入1 mL菌液，塞上試管塞并用保鮮膜裹嚴(yán)試管口，放入37 ℃生化恒溫箱中厭氧培養(yǎng)，根據(jù)上述測定的菌種生長曲線，培養(yǎng)至菌種的對數(shù)生長期，分別在不同菌種的各自對數(shù)期起始點(diǎn)取培養(yǎng)液在690 nm下測定吸光度，以不接菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)零。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定3組平行，根據(jù)培養(yǎng)前后吸光度差值得出益生菌在對數(shù)生長期的生長量。②試驗(yàn)組：在10 mL試管中準(zhǔn)確加入12 mL含有不同濃度枇杷葉提取液的培養(yǎng)基后，其余操作同上述對照組。

比較不同濃度的試驗(yàn)組和對照組生長量的差值，得出不同濃度的枇杷葉對益生菌的促生作用，差值越大，則說明該濃度的枇杷葉提取液對腸道益生菌生長的促生作用越顯著，以促生作用最顯著的濃度來配制增殖培養(yǎng)基。

1.2.7 枇杷葉對益生菌生長速率及pH值的影響 在10 mL試管中加入12 mL藥液培養(yǎng)基排盡試管內(nèi)空氣，接入1 mL菌液，塞上試管塞，并用保鮮膜包裹試管口，放入37 ℃生化恒溫箱中厭氧培養(yǎng)48 h，分別于0、8、12、16、20、24、30、36、42、48 h在690 nm下測定吸光值，以不接菌的藥液培養(yǎng)基調(diào)零，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)平行。同時(shí)測定pH值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定2組平行。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、pH值為縱坐標(biāo)繪制pH值變化曲線。將腸道益生菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長曲線及pH值作為對照，操作同上。

1.2.8 枇杷葉經(jīng)消化后對益生菌生長的影響（1）枇杷葉經(jīng)消化對青春雙歧桿菌生長曲線的影響：分別配制枇杷葉濃度為6 、8、10 g/L的消化液培養(yǎng)基，并做不加枇杷葉提取液的對照培養(yǎng)基。在10 mL試管中準(zhǔn)確加入12 mL消化液培養(yǎng)基，接入1 mL菌液，塞上試管塞，并用保鮮膜包裹接口，放入37 ℃生化恒溫箱中厭氧培養(yǎng)24 h，分別于0、2、4、……、24 h（每隔2 h）時(shí)取菌液在690 nm下測定吸光值，以不接菌的消化液培養(yǎng)基調(diào)零。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定3組平行。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度OD值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。（2）枇杷葉經(jīng)消化后對兩歧雙歧桿菌生長曲線的影響：分別配制枇杷葉濃度為2、4、6 g/L的消化液培養(yǎng)基，并做不加枇杷葉提取液的對照培養(yǎng)基，生長曲線的繪制方法同1.2.6（1）。（3）枇杷葉經(jīng)消化后對嗜酸乳桿菌生長曲線的影響：分別配制枇杷葉濃度為12、14、16 g/L的消化液培養(yǎng)基，并做不加枇杷葉提取液的對照培養(yǎng)基，生長曲線的繪制方法同1.2.6（1）。

1.2.9 枇杷葉對益生菌代謝產(chǎn)物的影響 根據(jù)田芬等[2]關(guān)于嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌的主代謝產(chǎn)物分析的報(bào)道，具體測定步驟：準(zhǔn)備2支10 mL試管，在每支試管中加入12 mL培養(yǎng)基排盡試管內(nèi)空氣，接入1 mL菌液，在37 ℃生化恒溫箱中厭氧培養(yǎng)24 h后取樣4 mL，置于18 ℃下凍藏。測定代謝產(chǎn)物時(shí)，解凍后于12 000 r/min離心機(jī)下離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm針孔濾膜過濾，置于樣品瓶，采用高效液相測定乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的含量。首先繪制標(biāo)準(zhǔn)品乙酸、丙酸、丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定樣品。色譜條件：色譜柱：HPX-87H（300 mm×7.8 mm，9 μm）;檢測器：RID214;流動(dòng)相：5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，溫度50 ℃，進(jìn)樣量10 μL，分離時(shí)間30 min。

1.2.10 枇杷葉對消化酶活性的影響 （1）酶液的制備：準(zhǔn)確稱取1.00 g胰蛋白酶（≥10 000 U/mg），用蒸餾水稀釋至500 mL;準(zhǔn)確稱取1.00 g胃蛋白酶（≥400 U/mg），用蒸餾水稀釋至250 mL[3]。（2）胃腸消化液的體外模擬：模擬胃液：取16.4 mL鹽酸（10.0%），用蒸餾水稀釋至pH為1，于121 ℃下高壓滅菌30 min，冷卻至室溫后，每100 mL加入1 mL胃蛋白酶酶液（≥400 U/mg）、0.5 g脂肪酶（100～500 U/mg），混勻后備用。模擬腸液：稱取6.8 g磷酸二氫鉀，加500 mL左右的蒸餾水溶解，用氫氧化鈉溶液（0.4%）調(diào)pH至6.8，加水稀釋至1 000 mL，于121 ℃下高壓滅菌30 min，冷卻至室溫后，每100 mL加入1 mL胰蛋白酶酶液（≥10 000 U/mg）、0.5 g脂肪酶（100～500 U/mg）、0.5 g淀粉酶（≥10 U/mg），混勻備用。（3）枇杷葉提取液的制備：稱取16 g枇杷葉，用1 000 mL蒸餾水浸泡30 min后大火煮沸，保持微沸狀態(tài)20 min，經(jīng)4層紗布過濾，重復(fù)煮2次，合并2次藥液。放至室溫后定容到1 000 mL容量瓶中，配制成16 g/L的枇杷葉提取液。分別取62.5、187.5 、375 mL的16 g/L枇杷葉提取液定容至500 mL容量瓶，配制成濃度分別為2 、6、12 g/L的枇杷葉提取液。（4）枇杷葉對消化酶活性的影響測定：取10 mL模擬胃液或模擬腸液置于50 mL燒杯中，分別加入5 mL不同濃度的枇杷葉提取液，空白對照組則加入5 mL蒸餾水，37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，然后測定α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的活力。（5）酶活的測定方法：α-淀粉酶活性測定參考趙蓉[13]的測定方法、蛋白酶活性測定參考GB23527蛋白酶制劑[14]的測定方法、脂肪酶活性測定參考GB23535脂肪酶制劑[15]的測定方法。

2 數(shù)據(jù)與分析

2.1 3種益生菌的生長曲線

根據(jù)圖1A可知，青春雙歧桿菌的遲緩期為8 h。由生長速率計(jì)算公式X=A（吸光度）h（培養(yǎng)時(shí)間）可知，于12 h時(shí)生長速率達(dá)到最大值0.049，于18 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。圖1B顯示，兩歧雙歧桿菌的遲緩期為10個(gè)小時(shí)，12 h時(shí)生長速率為0.028，從此進(jìn)入對數(shù)生長期，于18 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。由圖1C可知，嗜酸乳桿菌的遲緩期為4個(gè)小時(shí)，于10 h生長速率達(dá)到最大值0.054，16 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期。

2.2 枇杷葉對三種益生菌的增殖影響

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取濃度梯度為1～10 g/L的枇杷葉濃度來配制藥液培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照組。試驗(yàn)組與對照組相比較，得出不同濃度的枇杷葉提取液對青春雙歧桿菌生長的增殖作用。如圖2A所示，濃度為1 g/L和2 g/L的枇杷葉對青春雙歧桿菌表現(xiàn)出抑制作用，枇杷葉濃度為6 g/L時(shí)，青春雙歧桿菌的增殖量達(dá)到最大。此結(jié)果說明，枇杷葉在一定濃度范圍有利于青春雙歧桿菌的生長繁殖，從而有利于維持腸道微生態(tài)平衡，保持腸道健康，從而能夠促進(jìn)代謝廢物的排泄以及營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，間接降低血液中的葡萄糖水平。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取濃度梯度為1～10 g/L的枇杷葉濃度來配制藥液培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照組。試驗(yàn)組與對照組相比較，得出不同濃度的枇杷葉提取液對兩歧雙歧桿菌生長的增殖作用。如圖2B所示，枇杷葉提取液濃度為1～5 g/L時(shí)，兩歧雙歧桿菌的增殖量在0.1～0.15之間上下波動(dòng)，枇杷葉濃度為2 g/L時(shí)，兩歧雙歧桿菌的增殖量達(dá)到最大值。之后隨著枇杷葉濃度的增大，增殖量總體表現(xiàn)出下降趨勢，且枇杷葉提取液濃度大于6 g/L時(shí)，對兩歧雙歧桿菌的生長表現(xiàn)出抑制作用。此結(jié)果說明，存在一定濃度范圍內(nèi)的枇杷葉提取液對兩歧雙歧桿菌的生長起促進(jìn)作用，腸道中益生菌數(shù)目的增多，有利于維持腸道微生態(tài)的平衡，從而能夠促進(jìn)代謝廢物的排泄以及營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，間接降低血液中的葡萄糖水平。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取濃度梯度為8～17 g/L的枇杷葉提取液來配制藥液培養(yǎng)基，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照組。經(jīng)過與對照組相比，得出不同濃度的枇杷葉提取液對嗜酸乳桿菌生長的增殖作用。如圖2C所示，枇杷葉濃度為8～12 g/L時(shí)，隨著枇杷葉濃度的增大，嗜酸乳桿菌的增殖量也越大，并于12 g/L達(dá)到最大值。當(dāng)枇杷葉濃度超過12 g/L之后，嗜酸乳桿菌的增殖量以x軸為中線上下波動(dòng)。當(dāng)枇杷葉提取液濃度為14、15、17 g/L時(shí)，對嗜酸乳桿菌表現(xiàn)出抑制作用。此結(jié)果說明，當(dāng)枇杷葉提取液的濃度大于13 g/L時(shí)，對嗜酸乳桿菌生長的作用不顯著。

2.3 枇杷葉提取液對腸道益生菌生長速率的影響及pH值變化

2.3.1 濃度為6 g/L的枇杷葉提取液對青春雙歧桿菌生長速率的影響及pH值變化 由圖3A可知，在0～8 h內(nèi)，青春雙歧桿菌在兩種培養(yǎng)基中的生長速率基本保持一致;在8～12 h內(nèi)，青春雙歧桿菌在增殖培養(yǎng)基中的生長速率顯著高于其在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長速率，且生長量也較高;在增殖培養(yǎng)基中，青春雙歧桿菌在12 h后一直保持在生長量較高的水平，但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，青春雙歧桿菌在12 h后進(jìn)入到衰亡期，菌量持續(xù)降低，20 h后進(jìn)入到平穩(wěn)狀態(tài)。由此可得出，枇杷葉在一定濃度下對青春雙歧桿菌具有益生作用，且能顯著延長其生長期。根據(jù)圖3B可知，在0～16 h內(nèi)，菌液的pH值呈下降趨勢，但在增殖培養(yǎng)基中，菌液的pH值下降趨勢較緩;16 h后，菌液pH值基本重合。由此初步說明，雖然枇杷葉對青春雙歧桿菌具有顯著增殖作用，但對其代謝產(chǎn)生的脂肪酸總量無顯著影響，且pH的緩慢變化有利于維持腸道微生態(tài)平衡，保持腸道健康，從而能夠促進(jìn)代謝廢物的排泄以及營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，間接降低血液中的葡萄糖水平。

2.3.2 濃度為2 g/L的枇杷葉提取液對兩歧雙歧桿菌生長速率的影響及pH值變化 根據(jù)圖4A可知，在0～12 h內(nèi)，兩歧雙歧桿菌在增殖培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中都處于對數(shù)生長期，且均在培養(yǎng)時(shí)間為8 h時(shí)生長速率達(dá)到最大值;但在增殖培養(yǎng)基中的生長速率顯著較高。在12～48 h內(nèi)，兩歧雙歧桿菌在增殖培養(yǎng)基中的菌數(shù)基本穩(wěn)定，且表現(xiàn)出繼續(xù)生長繁殖的趨勢;但在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中表現(xiàn)出衰亡的趨勢，直至20 h后保持穩(wěn)定。圖4B表明，在0～12 h內(nèi)，菌液的pH值呈現(xiàn)下降趨勢，但增殖培養(yǎng)基的pH值下降速度更快;12 h后，兩曲線基本重合。圖4說明，枇杷葉在一定濃度范圍內(nèi)對兩歧雙歧桿菌同樣具有顯著的增殖作用;但對代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的總量無影響，且腸道益生菌的增加和pH的緩慢變化均有利于維持腸道微生態(tài)平衡，保持腸道健康，間接降低血糖水平。

2.3.3 濃度為12 g/L的枇杷葉提取液對嗜酸乳桿菌生長速率的影響及pH值變化

根據(jù)圖5A可知，嗜酸乳桿菌在增殖培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長狀況基本保持一致，甚至在24 h之前，嗜酸乳桿菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長量高于在增殖培養(yǎng)基中的生長量。因此，枇杷葉提取液對嗜酸乳桿菌生長的增殖作用不顯著。由圖5B可見，在0～16 h內(nèi)，菌液的pH值呈下降趨勢，但在增殖培養(yǎng)基中，菌液的pH值下降趨勢較緩;16 h后，菌液pH值基本重合。此結(jié)果說明，枇杷葉提取液有利于益生菌增殖，促進(jìn)腸道代謝及廢物的排泄，維持腸道微生態(tài)的穩(wěn)定性，從而達(dá)到降低血糖濃度的目的。

2.4 消化后的枇杷葉提取液對腸道益生菌生長速率的影響

考慮到枇杷葉提取液經(jīng)消化后功效可能會(huì)有所下降，因此選取了3個(gè)濃度的枇杷葉提取液進(jìn)行對比，同時(shí)以未加枇杷葉提取液的消化液來做空白對照，其生長曲線如下圖所示。據(jù)圖6可知，試驗(yàn)組和對照組中腸道益生菌的生長量都較小，且對照組的生長量較高。結(jié)果表明，枇杷葉提取液經(jīng)消化后對腸道益生菌的促生作用明顯降低，甚至表現(xiàn)出抑制作用，說明枇杷葉經(jīng)過胃腸道消化酶作用后，其功能性物質(zhì)會(huì)被大量分解，從而導(dǎo)致其藥效降低。

2.5 枇杷葉提取液消化前后對腸道益生菌代謝產(chǎn)物的影響

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果見表2。

2.5.2 樣品檢測結(jié)果 以腸道益生菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長24 h后的代謝產(chǎn)物為空白對照，測定枇杷葉提取液消化前后對腸道益生菌代謝產(chǎn)物的影響。據(jù)圖7可知，枇杷葉提取液改變了雙歧桿菌產(chǎn)酸的比例，空白對照組的青春雙歧桿菌三種代謝產(chǎn)物含量為乙酸>丙酸>丁酸;而在試驗(yàn)組中，青春雙歧桿菌的三種代謝產(chǎn)物含量為丙酸>乙酸>丁酸。整體來看，試驗(yàn)組中丙酸含量要明顯高于對照組，而其他兩種酸的含量差別并不明顯。王子花等[16]研究表明，丙酸經(jīng)結(jié)腸吸收后由肝臟代謝用作能源，并可以抑制肝膽固醇的合成。且長期給予丙酸鹽可降低空腹血糖濃度，這可能與抑制肝臟中肝糖原分解釋放葡萄糖有關(guān)。因此可以推斷枇杷葉提取液是通過改變代謝產(chǎn)物中丙酸的含量達(dá)到降低血糖濃度的作用。據(jù)圖7C可知，試驗(yàn)組和空白對照組嗜酸乳桿菌三種代謝產(chǎn)物含量的區(qū)別并不明顯，正如圖5所示，枇杷葉提取液對嗜酸乳桿菌生長的增殖作用不顯著。

2.6 枇杷葉提取液對消化酶活性的影響

2.6.1 蛋白酶活性 （1）濃度分別為2、6、12 g/L的枇杷葉提取液對胃蛋白酶活力的影響：據(jù)表3可知，在模擬胃液中，濃度為6 g/L的枇杷葉提取液能有效提高胃蛋白酶的活力，而濃度為2 g/L和12 g/L的枇杷葉提取液表現(xiàn)出對胃蛋白酶活力的抑制作用，抑制效果為：12 g/L>2 g/L，說明在一定濃度范圍內(nèi)，枇杷葉能夠抑制胃的消化能力，從而降低食物的消化吸收率。（2）濃度分別為2 、6、12 g/L的枇杷葉提取液對胰蛋白酶活力的影響：據(jù)表4可知，在模擬腸液中，3種濃度的枇杷葉提取液均能有效提高胰蛋白酶活力，且促進(jìn)效果為：6 g/L>2 g/L>12 g/L。說明在一定濃度范圍內(nèi)，枇杷葉可以顯著提高小腸對蛋白質(zhì)的消化能力。

2.6.2 胰淀粉酶活性 據(jù)表5可知，3個(gè)濃度的枇杷葉提取液都對胰淀粉酶活力表現(xiàn)出抑制作用，且抑制效果為12 g/L>6 g/L>2 g/L，這說明，枇杷葉可以通過降低淀粉在腸道中的消化率來起到降血糖的作用。

2.6.3 胰脂肪酶活性 根據(jù)表6可知，在模擬腸液中，不同濃度的枇杷葉提取液均對胰脂肪酶活力的影響不顯著。因此，在所研究范圍內(nèi)，枇杷葉提取液對脂肪的消化吸收無顯著影響。

3 討論

（1）在確定不同濃度的枇杷葉提取液對腸道益生菌的增殖作用時(shí)，所選用的方法是比較其對數(shù)生長期的生長量，確定對數(shù)期的時(shí)間范圍的依據(jù)是腸道益生菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長曲線，因此在不同濃度枇杷葉提取液中腸道益生菌對數(shù)期的時(shí)間范圍會(huì)有所差距，這就造成了腸道益生菌在增殖培養(yǎng)基中的生長曲線與上一步所測得的結(jié)果有所差距。（2）結(jié)合生長曲線圖和pH值變化曲線圖來看，腸道益生菌在生長曲線出現(xiàn)較大區(qū)別時(shí)pH值得變化曲線卻基本重合，因此基本可以確定枇杷葉提取液沒有改變腸道益生菌代謝物中短鏈脂肪酸的總含量。（3）枇杷葉提取液經(jīng)體外模擬胃腸道消化后，培養(yǎng)基中出現(xiàn)沉淀物質(zhì)，絕大部分為不溶于水的膽鹽，在測量吸光度時(shí)可能會(huì)造成一定的誤差;膽鹽能刺激腸道的蠕動(dòng)功能，抑制腸道細(xì)菌的生長，這也可能是出現(xiàn)抑制作用的原因。根據(jù)枇杷葉對消化酶活力影響的試驗(yàn)結(jié)果來看，可以推斷出由于一定濃度的枇杷葉提取液促進(jìn)了蛋白酶活力，造成了培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的損失，這也可能是腸道益生菌生長量減少的原因。

4 結(jié)論

（1）一定濃度的枇杷葉提取液對單獨(dú)培養(yǎng)的雙歧桿菌有明顯的促進(jìn)作用，濃度為6 g/L的枇杷葉提取液對青春雙歧桿菌的增殖作用最顯著，濃度為2 g/L的枇杷葉提取液對兩歧雙歧桿菌的增殖作用最顯著。枇杷葉提取液對嗜酸乳桿菌的促進(jìn)作用不明顯。（2）枇杷葉提取液經(jīng)消化后對腸道益生菌的促生作用明顯降低，甚至表現(xiàn)出抑制作用。（3）在代謝產(chǎn)物測定的試驗(yàn)中，試驗(yàn)組中丙酸含量要明顯高于對照組，而其他兩種酸的含量差別并不明顯，因此可以推斷枇杷葉可能通過顯著增加代謝產(chǎn)物中丙酸的含量達(dá)到降血糖的目的。（4）從枇杷葉提取液對消化酶活力影響試驗(yàn)可知，濃度為6 g/L的枇杷葉提取液對蛋白酶活力的促進(jìn)作用最為顯著;3種濃度的枇杷葉提取液對胰脂肪酶活力的影響可以忽略不計(jì);但枇杷葉提取液都對胰淀粉酶活力表現(xiàn)出抑制作用，且抑制效果為：12 g/L>6 g/L>2 g/L，由此也可知，枇杷葉可以通過降低淀粉酶的活性來達(dá)到降血糖的目的?！?/p>

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Hypoglycemic Effect of Loquat Leaves Based on Intestinal Enzymes and Probiotics

CHEN Rong1，F(xiàn)AN Li-li1，LU Jia-ru1，QI Jing1，SHEN Ying-bin2

（1College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China;2School of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China）

Abstract：Objective The hypoglycemic effect of loquat leaf extract was discussed by studying the effects of loquat leaf extract on the growth and metabolism of intestinal probiotic bacteria before and after digestion，as well as the effect on digestive enzyme activity.Method The effects of different concentrations of loquat leaf extract on the proliferation of three kinds of intestinal probiotics and the activities of intestinal digestive enzymes were investigated by in vitro experiments.The effect of loquat leaf extract on intestinal probiotics was also discussed.Result A certain concentration of loquat leaf extract had significant promotion effect on the separately cultured bifidobacteria，but it had no significant effect on the growth and metabolism of L.acidophilus.The effect of loquat leaf extract on the intestinal probiotics after digestion was significantly reduced，and even showed inhibitory effect.The content of propionic acid in the metabolites of the experimental group was significantly higher than that of the control group，while the content of the other two acids was not significantly different.The loquat leaf extract with the concentration of 6 g/L had the most significant effect on promoting the activity of protease，however，the three concentrations of loquat leaf extract studied had inhibitory effect on pancreatic amylase activity，while vitality had no significant effect.Conclusion Blood glucose concentration was reduced might due to the amylase activity was inhibited by loquat leaf extract and the propionic acid content in probiotic metabolites was increased.

Keywords：loquat leaf;intestinal probiotics;digestive enzyme;simulated digestion;hypoglycemia