杜經(jīng)緯?彭麗娟?吉爽?楊燕?馮俊

【摘要】目的 探討微RNA-21（miR-21）在脂多糖誘導(dǎo)的人鼻黏膜上皮細(xì)胞（HNEpC）中表達(dá)變化及可能的作用機(jī)制。方法 應(yīng)用脂多糖誘導(dǎo)建立HNEpC炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型，分別應(yīng)用熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法檢測炎癥細(xì)胞模型建立前后miR-21和磷酸酶及張力蛋白同源物 （PTEN）蛋白的表達(dá)水平變化。取脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC細(xì)胞，分為miR-21抑制物組和陰性對照組，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將miR-21抑制物和陰性對照物轉(zhuǎn)染入2組HNEpC細(xì)胞，比較轉(zhuǎn)染后2組細(xì)胞中miR-21和PTEN蛋白的表達(dá)、細(xì)胞增殖活性和凋亡率以及細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的水平。結(jié)果 脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平增高（P < 0.05），PTEN蛋白的表達(dá)水平降低（P < 0.05）。miR-21抑制物組細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平低于陰性對照組（P < 0.05），轉(zhuǎn)染后24、48、72 h后的吸光度值均低于陰性對照組（P均 < 0.05），凋亡率高于陰性對照組（P < 0.05），并且細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均低于陰性對照組（P均 < 0.05），IL-10水平高于陰性對照組（P < 0.05），細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平高于陰性對照組（P < 0.05）。結(jié)論 miR-21在脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型中表達(dá)升高，抑制miR-21可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC細(xì)胞的增殖活性和炎癥反應(yīng)，同時促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與其對PTEN基因的調(diào)控有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】人鼻黏膜上皮細(xì)胞;微核糖核酸-21;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;炎癥反應(yīng);磷酸酶及張力蛋白同源物

Changes of miR-21 expression and mechanism in human nasal epithelial cells induced by lipopo-lysaccharide Du Jingwei， Peng Lijuan， Ji Shuang， Yang Yan， Feng Jun. Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery， the Second Clinical Medical College of North Sichuan Medical College/Nanchong Central Hospital， Nanchong 637000， China

Corresponding author， Peng Lijuan， E-mail： zbdpr9@ 163. com

【Abstract】Objective? To investigate the changes of microRNA-21 （miR-21） expression in human nasal epithelial cells （HNEpC） induced by lipopolysaccharide （LPS） and unravel the potential mechanism.Methods HNEpC inflammatory cell model was induced by LPS. The changes of the expression levels of miR-21 and phosphatase and tensin homologue （PTEN） protein before and after establishment of the inflammatory cell model were detected by qRT-PCR and Western blot. HNEpC cells induced by LPS were collected and divided into the miR-21 inhibitor group and negative control group. HNEpC cells were transfected with miR-21 inhibitor and negative controls by using the liposome transfection method. After cell transfection， the expression levels of miR-21 and PTEN protein， cell proliferation activity， apoptosis rate， and the expression levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-10 in the cell supernatant were measured and statistically compared between two groups. Results In the HNEpC cells induced by LPS， the expression level of miR-21 was significantly up-regulated （P < 0.05）， whereas that of PTEN protein was significantly down-regulated （P < 0.05）. Compared with the negative control group， the expression level of miR-21 was significantly lower （P < 0.05）， the OD values at 24， 48 and 72 h after cell transfection were significantly lower （all P < 0.05）， the apoptosis rate was significantly higher （P < 0.05）， the expression levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in the cell supernatant were significantly lower （all P < 0.05）， the expression level of IL-10 was significantly higher （P < 0.05），and the expression level of PTEN protein was significantly higher in the miR-21 inhibitor group （P < 0.05）， respectively. Conclusions The expression level of miR-21 is up-regulated in the LPS-induced HNEpC inflammatory cell model. Inhibition of miR-21 expression can significantly suppress the proliferation activity and inflammatory response of HNEpC cells induced by LPS and promote the cell apoptosis. The underlying mechanism may be related to the regulation of PTEN gene.

【Key words】Human nasal epithelial cell;MicroRNA-21;Cell proliferation;Apoptosis;Inflammatory response;Phosphates and tensin homologue

慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉（CRSwNP）是耳鼻喉科常見疾病之一，為鼻黏膜持續(xù)性的、過度的慢性黏膜炎癥反應(yīng)，常見于老年人、哮喘患者，發(fā)病率男性高于女性，患者形成鼻息肉，臨床癥狀表現(xiàn)為鼻塞、膿涕、張口呼吸等。患者嗅覺減退，當(dāng)中鼻甲嚴(yán)重壓迫鼻中隔時會引發(fā)篩前神經(jīng)綜合征，嚴(yán)重影響患者的日常生活[1]。臨床治療CRSwNP手段眾多，包括藥物、按摩、熱療及手術(shù)切除，但患者即便是得到規(guī)范性的藥物、手術(shù)治療，其復(fù)發(fā)率仍處于較高水平，因此學(xué)者們也在積極探索CRSwNP發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以期為臨床治療提供新的途徑[2-3]。

在研究CRSwNP發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的過程中，學(xué)者們越來越多地關(guān)注到微RNA（miR）所扮演的角色。miR是一類非編碼的小分子RNA，可通過調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程，在鼻咽癌、變應(yīng)性鼻炎、慢性鼻-鼻竇炎等疾病中均發(fā)揮著重要的作用[4]。miR-21是miRNA家族中的一個重要成員，位于人染色體17q23.2上，具有高度的保守性。研究表明miR-21廣泛參與調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥免疫反應(yīng)，在多種炎性反應(yīng)中表達(dá)水平均有明顯升高的現(xiàn)象[5-6]。近期Li等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)miR-21在CRSwNP組織中表達(dá)明顯升高，并且與鼻黏膜上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有關(guān)，但是作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究選取人鼻黏膜上皮細(xì)胞（HNEpC）作為研究對象，觀察miR-21對脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC增殖、凋亡及炎癥因子水平的影響，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料與試劑

HNEpC購自上海滬震公司;脂多糖購自美國sigma公司;miR-21抑制物miR-21 inhibitor、陰性對照物inhibitor-NC及所有引物購自上海吉瑪公司;TRIzol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司;CCK-8試劑盒購自上海雅吉生物公司;凋亡檢測試劑盒購自上海群己生物公司;TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的ELISA試劑盒均購自南京建成生物公司;一抗磷酸酶及張力蛋白同源物 （PTEN）、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司;二抗購自北京中杉金橋公司。

二、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HNEpC按照說明書在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置入37℃、5% CO2條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時，胰酶消化、傳代。應(yīng)用脂多糖誘導(dǎo)HNEpC細(xì)胞時，按照終濃度1 mg/L脂多糖刺激細(xì)胞時間的不同分為0 h組、12 h組、24 h組、48 h組。轉(zhuǎn)染操作時，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的HNEpC細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞板，細(xì)胞分為miR-21抑制物組和陰性對照組，應(yīng)用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒參照說明書進(jìn)行操作，分別將miR-21 inhibitor和inhibitor-NC轉(zhuǎn)染至HNEpC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h再用脂多糖（1 mg/L）刺激細(xì)胞24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.熒光定量-PCR（qRT-PCR）

應(yīng)用TRIzol試劑提取HNEpC細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，應(yīng)用qRT-PCR試劑盒配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃5 min;95℃?20 s，60℃45 s，共進(jìn)行45個循環(huán)。miR-21引物：上游5-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3，下游5-TGCGTGTCGTGGAGTC-3;內(nèi)參基因U6引物：上游5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游5-AA CGCTTCACGAATTTGCGT-3。miR-21相對表達(dá)水平應(yīng)用2-△△Ct法進(jìn)行計算。

3. CCK-8實驗

取各組脂多糖刺激24 h后的HNEpC細(xì)胞，于檢測前1 h 加入10 μl CCK-8溶液，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測得各組HNEpC細(xì)胞不同時點在450 nm波長處的吸光度值（OD450）。

4.流式細(xì)胞術(shù)

取各組脂多糖刺激24 h后的HNEpC細(xì)胞，胰蛋白酶消化后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞3次，Bingding Buffer液重懸細(xì)胞，分別依次加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 5μl，充分混勻后于室溫下避光反應(yīng)15 min，立即采用流式細(xì)胞儀檢測各組HNEpC細(xì)胞的凋亡率。

5. ELISA

取各組脂多糖刺激24 h后HNEpC細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等炎性因子的水平。

6.蛋白免疫印跡法

收集HNEpC細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞后，裂解提取細(xì)胞總蛋白，BCA法行蛋白定量制備樣品。各組細(xì)胞取等量蛋白上樣行SDS-PAGE、半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，應(yīng)用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，細(xì)胞洗滌后，分別加入一抗PTEN（稀釋度1∶1000）和GAPDH（稀釋度1∶2000）抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗，室溫孵育1 ～ 2 h，ECL顯影、定影。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)，實驗均重復(fù)3次，正態(tài)分布計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnet-t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、脂多糖誘導(dǎo)前、后HNEpC細(xì)胞中miR-21和PTEN蛋白的表達(dá)變化

qRT-PCR結(jié)果顯示，脂多糖誘導(dǎo)后12、24、48 h時細(xì)胞中miR-21的相對表達(dá)水平均高于脂多糖誘導(dǎo)前（F = 126.623，P < 0.01，多重比較P均 < 0.05），見圖1A。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，脂多糖誘導(dǎo)后12、24、48 h時細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平均低于脂多糖誘導(dǎo)前（F = 48.251，P < 0.01，多重比較P均 < 0.05），見圖1B。

二、抑制miR-21對HNEpC細(xì)胞增殖活性的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-21抑制物組細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平低于陰性對照組（t = 8.369，P = 0.001），見圖2A。CCK-8實驗結(jié)果顯示，miR-21抑制物組24、48、72 h的OD值均低于陰性對照組（t24 h = 4.493，t48 h = 5.343，t72 h = 6.251，P均 < 0.05），見圖2B。

三、抑制miR-21對HNEpC細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，miR-21抑制物組細(xì)胞凋亡率為（27.5±4.9）%，高于陰性對照組的（13.0±3.4）%，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 4.211，P = 0.014），見圖3。

四、抑制miR-21對HNEpC細(xì)胞炎性因子水平的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，miR-21抑制物組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于陰性對照組（P均 < 0.05），而IL-10水平高于陰性對照組（P < 0.05），見表1。

五、抑制miR-21對HNEpC細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)水平的影響

蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，miR-21抑制物組細(xì)胞PTEN蛋白的相對表達(dá)水平為0.89±0.21，高于陰性對照組的0.31±0.12，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 4.154，P = 0.014），見圖4。

討論

CRSwNP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，需要長期規(guī)范性的用藥治療，甚至需要行鼻內(nèi)鏡切除術(shù)，然而仍有相當(dāng)一部分患者嚴(yán)格遵守治療原則，其仍有較高的復(fù)發(fā)率[8-10]。因此探索CRSwNP炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，幫助臨床醫(yī)師尋求新的治療途徑，已成為當(dāng)前學(xué)者的研究重點。隨著miR在各疾病中作用的不斷探索，近年來其在CRSwNP中的作用機(jī)制也是研究熱點之一。Li等[11]發(fā)現(xiàn)miR-4492在CRSwNP組織中表達(dá)下調(diào)，可能通過JAK/STAT信號通路參與CRSwNP的發(fā)生進(jìn)展。鄭輝等[12]發(fā)現(xiàn)抑制miR-107表達(dá)能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC的炎癥反應(yīng)和增殖從而參與CRSwNP的發(fā)生進(jìn)展。miR的發(fā)現(xiàn)為臨床治療CRSwNP提供了新的研究方向[4]。

HNEpC呼吸道防御病原物、過敏原及污染物等入侵的第一道屏障，在慢性鼻-鼻竇炎的炎癥反應(yīng)和鼻息肉的形成中扮演著極其重要的角色，HNEpC異常增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)是鼻息肉的形成的關(guān)鍵[13-14]。脂多糖為糖脂化合物，為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可誘導(dǎo)HNEpC發(fā)生炎癥反應(yīng)而誘發(fā)CRSwNP的發(fā)生。應(yīng)用脂多糖誘導(dǎo)HNEpC作為研究對象是研究CRSwNP常用細(xì)胞模型[15-16]。miR-21是近期發(fā)現(xiàn)與炎癥免疫反應(yīng)密切相關(guān)的miR家族成員之一，但是miR-21在CRSwNP中的作用機(jī)制尚不清楚。

本研究中我們通過觀察脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC細(xì)胞不同時間的miR-21表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平明顯增高，提示異常高表達(dá)的miR-21可能參與了CRSwNP的發(fā)生發(fā)展。為了進(jìn)一步探討miR-21對脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，我們通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR-21抑制物至HNEpC細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-21表達(dá)的HNEpC細(xì)胞，經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)后24、48、72 h的吸光度值均明顯降低，而凋亡率明顯升高，并且細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平均明顯下降，而IL-10水平明顯上升，提示抑制miR-21可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC細(xì)胞的增殖活性和炎癥反應(yīng)，同時促進(jìn)其凋亡，從而參與CRSwNP的發(fā)生發(fā)展。

PTEN是人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，是目前研究中證實與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的基因之一。PTEN基因編碼雙重底物特異性磷酸酶，具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性，能夠抑制PI3K/AKT信號通路從而起到抗炎作用[17]。既往研究者發(fā)現(xiàn)PTEN在CRSwNP中表達(dá)降低，PTEN能夠增強(qiáng)HNEpC對炎癥的抵抗力[18-19]。抑制PTEN的表達(dá)既能抑制上呼吸道黏膜纖毛細(xì)胞的凋亡，又能誘導(dǎo)上皮化生杯狀細(xì)胞，從而增加黏膜上皮中黏液的分泌，降低排黏液功能[20]。國內(nèi)外多個研究表明，miR-21可通過調(diào)控PTEN基因參與細(xì)胞增殖、凋亡并介導(dǎo)多種炎性反應(yīng)[21-22]。因此我們推測miR-21在CRSwNP中的作用可能與其調(diào)控PTEN有關(guān)。在本研究中我們通過蛋白免疫印跡法發(fā)現(xiàn)，脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平明顯降低。并且我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21表達(dá)的HNEpC細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平明顯升高，提示miR-21能夠靶向調(diào)控HNEpC細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)，miR-21對脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC增殖、凋亡及炎癥因子水平的影響可能與其對PTEN基因的調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，miR-21在脂多糖誘導(dǎo)的HNEpC炎癥反應(yīng)細(xì)胞模型中表達(dá)升高，抑制miR-21可顯著抑制HNEpC炎癥反應(yīng)細(xì)胞的增殖活性和炎癥反應(yīng)，同時促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與其對PTEN基因的調(diào)控有關(guān)，為CRSwNP的治療提供了新的研究方向。

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（收稿日期：2021-01-05）

（本文編輯：楊江瑜）