王一強(qiáng) ,李 晶 ,張玉香 ,張 瑞 ,史曉偉

（1.甘肅衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730300；2.蘭州大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730070）

2015 版中國(guó)藥典規(guī)定，車(chē)前科植物車(chē)前Plantago asiatica L.或平車(chē)前 Plantago depressa Willd.的干燥全草作車(chē)前草用[1]。別名:當(dāng)?shù)?、牛遺、牛舌草、車(chē)輪草、豬耳草、車(chē)轱轆菜、五根草等[2]，具有利尿通淋、涼血解毒、祛痰的功效，用于暑濕泄瀉，熱淋澀痛，水腫尿少、痰熱咳嗽、吐血衄血、癰腫瘡毒等[3-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，車(chē)前草中含有黃酮類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、三萜及甾醇類(lèi)、揮發(fā)油、微量元素等多種有效成分，具有抗菌消炎、利尿、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗?jié)?、修?fù)受損細(xì)胞、降血糖、降血壓、降血脂等藥理作用[6-10]。

我國(guó)將車(chē)前作為中藥材使用的歷史悠久，其道地產(chǎn)區(qū)為江西贛江沿岸[11-12]?！秷D經(jīng)本草》中記載，車(chē)前產(chǎn)地有陜西和甘肅，屬于西北地區(qū)[13]，劉遠(yuǎn)平[14]在小隴山林區(qū)車(chē)前草開(kāi)發(fā)前景和陳拓[15]等人在甘肅馬銜山平車(chē)前葉片δ13C 的海拔和時(shí)間差異的研究中顯示，甘肅也分布有一定規(guī)模的車(chē)前草。

本實(shí)驗(yàn)采用水負(fù)荷大鼠模型，研究江西車(chē)前草與甘肅車(chē)前草對(duì)水負(fù)荷大鼠的利尿作用，為進(jìn)一步研究甘肅車(chē)前草臨床利尿作用和擴(kuò)大其栽培規(guī)模提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF 級(jí)別，同批雄性SD 大鼠100 只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(150±20)g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(甘)2011-0001。實(shí)驗(yàn)前將動(dòng)物置于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1 周，室溫18℃～20℃，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，飲用自來(lái)水。

1.2 藥物與試劑

車(chē)前草（安國(guó)市廣濟(jì)堂，批號(hào)：19022805，產(chǎn)區(qū)：江西）；甘肅車(chē)前草（經(jīng)鑒定為車(chē)前科車(chē)前屬平車(chē)前的干燥全草，產(chǎn)區(qū)：甘肅天水小隴山）；氫氯噻嗪片（天津力生制藥有限公司，批號(hào)：2003002）；血尿素氮（BUN）測(cè)試盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)；碳酸酐酶(CA)試劑盒(上?？迫A生物工程股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

5417R 低溫高速離心機(jī)(德國(guó)EPPENDORF 公司)；HH-S 型數(shù)顯恒溫水浴箱(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng))；ZY KHB-1280 型全自動(dòng)生化儀(上海科華生物工程股份有限公司)；WFX-120A 原子吸收分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman-coulter 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試樣液制備

江西、甘肅車(chē)前草各500g，適量粉碎，用80%乙醇浸泡12h 后，4 倍量80%乙醇回流提取3 次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液并回收溶劑至干。江西、甘肅車(chē)前草醇提物用0.9% NaCl 溶液混懸，分別制成生藥含量1.6 g/ml，0.4 g/ml，0.1 g/ml 的試樣液；陽(yáng)性對(duì)照藥氫氯噻嗪用0.9% NaCl 溶液配成0.4 mg/ml 的溶液。

2.2 動(dòng)物分組與造模

采用Aston 法[16-18]將SD 大鼠預(yù)先禁食(不禁水)18 h，2.5 mL/100g 去離子水灌胃，收集2 h 尿量，選擇2 h 出入量比值＞40%的大鼠進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

篩選合格SD 大鼠80 只，隨機(jī)分為8 組，每組10 只，分別為：空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，江西車(chē)前草高劑量組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)江草高）、中劑量組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)江草中）、低劑量組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)江草低），甘肅車(chē)前草高劑量組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)甘草高）、中劑量組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)甘草中）、低劑量組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)甘草低）。實(shí)驗(yàn)大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠適應(yīng)2d，代謝籠中適應(yīng)3d，實(shí)驗(yàn)前禁食(不禁水)18h，以減少糞便的干擾。每組大鼠按25 mL/kg 體質(zhì)量，用生理鹽水灌胃，造成水鈉潴留狀態(tài)。

2.3 給藥方法

造模結(jié)束30 min 后，輕壓大鼠下腹，排盡余尿，各組進(jìn)行灌胃治療。實(shí)驗(yàn)時(shí)，各藥物組給予含試樣藥物的0.9% NaCl 25 mL/kg，其中藥物組高、中、低劑量組分別含生藥量1.6 g/ml、0.4 g/ml、0.1 g/ml，陽(yáng)性對(duì)照組含氫氯噻嗪0.4 mg/ml，空白對(duì)照組給予同體積生理鹽水。

2.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 大鼠排尿量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)各組大鼠分別于給藥第1d 收集大鼠1h、2h、4h、6h、24 h 的尿液，測(cè)定尿液體積并凍存于－20℃冰箱。

2.4.2 尿液中Cl－、Na+、K+濃度的測(cè)定

稱(chēng)取一定量NaCl 和KCl，配制成標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。取出凍存于－20℃冰箱中的尿液，室溫溶解并稀釋至一定濃度，用原子分光光度計(jì)在766.5nm 處檢測(cè)K+濃度，在589nm 處檢測(cè)Na+濃度，精確吸取適量尿液并稀釋至一定濃度，滴加5% K2CrO41 滴，搖晃均勻，緩緩加入AgNO3標(biāo)準(zhǔn)液，邊滴邊搖至橘紅色不褪色為止，記錄消耗的AgNO3標(biāo)準(zhǔn)液的體積，計(jì)算尿液中的Cl－濃度。

2.4.3 血尿素氮（BUN）和碳酸酐酶(CA)水平的測(cè)定

連續(xù)給藥6 d,第6 d 給藥1 h 后處死大鼠，取血約2 mL，立即放入低溫離心機(jī)，1000 r/min 離心5 min，得到血清。按大鼠BUN 試劑盒和CA 試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素方差分析法，以P＜0.05 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)水負(fù)荷大鼠排尿量的影響

由表1 可知，與空白對(duì)照組比較，車(chē)前草醇提物1 h 內(nèi)的利尿效果不顯著，陽(yáng)性對(duì)照組的利尿效果顯著（*P＜0.05）；1～4h 內(nèi)，江草高組和甘草高組具有極顯著的利尿效果（**P＜0.01），江草中、低組和甘草中組具有顯著的利尿效果（*P＜0.05）；江草高、中、低劑量組和甘草高、中劑量組24 h 內(nèi)的利尿效果有極顯著性差異（**P＜0.01）。6 h后，甘草低劑量組與江草高劑量組比較，有顯著性差異（ΔP＜0.05）。

表1 車(chē)前草醇提物對(duì)水負(fù)荷大鼠排尿量的影響（±s）

表1 車(chē)前草醇提物對(duì)水負(fù)荷大鼠排尿量的影響（±s）

注：與空白組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與江草高組比較ΔP＜0.05。

綜上所述，車(chē)前草提取物有明顯的利尿作用，但江西車(chē)前草的利尿作用稍強(qiáng)于甘肅車(chē)前草。

3.2 對(duì)水負(fù)荷大鼠尿液中Cl-、Na+、K+濃度的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組、江草高劑量組和甘草高劑量組大鼠尿液中Cl－、Na+、K+濃度與空白對(duì)照組比較，有極顯著性差異（**P＜0.01），江草中劑量組和甘草中劑量組（對(duì)Cl－濃度的影響除外）對(duì)水負(fù)荷大鼠Cl－、Na+、K+的排泄也具有顯著的促進(jìn)作用（*P＜0.05）。與江草高劑量組比較，甘草低劑量組對(duì)水負(fù)荷大鼠Cl-、Na+、K+的排泄作用最弱。見(jiàn)表2。

表2 車(chē)前草醇提物對(duì)大鼠尿液中Cl－、Na+、K+濃度的影響（±s）

表2 車(chē)前草醇提物對(duì)大鼠尿液中Cl－、Na+、K+濃度的影響（±s）

注：與空白組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，與江草高組比較ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01。

綜上所述，車(chē)前草醇提物有明顯促進(jìn)Cl－、Na+、K+排泄的作用，但江西車(chē)前草的促進(jìn)作用稍強(qiáng)于甘肅車(chē)前草。

3.3 對(duì)水負(fù)荷大鼠BUN 和CA 水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，江草高劑量組與甘草高劑量組的BUN 濃度和CA 濃度明顯下降，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（*P＜0.05），其他劑量組無(wú)差異。與江草高劑量組比較，甘草低劑量組的BUN 濃度和CA 濃度明顯升高，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ΔP＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 車(chē)前草醇提物對(duì)大鼠BUN 和CA 水平的影響（±s）

表3 車(chē)前草醇提物對(duì)大鼠BUN 和CA 水平的影響（±s）

注：與空白組比較＊P＜0.05，與江草高組比較ΔP＜0.05。

初步說(shuō)明，車(chē)前草醇提物對(duì)水負(fù)荷大鼠的腎小球?yàn)V過(guò)功能有影響，且江蘇車(chē)前草的腎小球?yàn)V過(guò)功能稍強(qiáng)于甘肅車(chē)前草。

4 討論

車(chē)前草具有利尿通淋的功效，水負(fù)荷大鼠排尿量和電解質(zhì)的排泄是影響車(chē)前草利尿作用的重要因素。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典利尿模型，針對(duì)道地產(chǎn)區(qū)江西車(chē)前草和甘肅產(chǎn)車(chē)前草醇提物對(duì)水負(fù)荷大鼠的利尿作用進(jìn)行比較觀察，發(fā)現(xiàn)車(chē)前草醇提物具有利尿效果，且江西車(chē)前草的利尿效果強(qiáng)于甘肅車(chē)前草，但同等劑量下兩者比較差異不明顯。

排尿量的變化可以影響尿液中Cl-、Na+、K+的排泄，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，車(chē)前草醇提物有明顯促進(jìn)Cl-、Na+、K+排泄的作用，但江西車(chē)前草對(duì)Cl-、Na+、K+的排泄作用強(qiáng)于甘肅車(chē)前草?？梢缘贸觯?chē)前草醇提物可能是通過(guò)增加尿液排泄量和尿液中Cl-、Na+、K+的排泄量而達(dá)到利尿效果，且生含藥量達(dá)到10g/kg 時(shí)才有效。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，江西車(chē)前草高劑量組與甘肅車(chē)前草高劑量組對(duì)BUN 濃度有明顯的降低作用，說(shuō)明車(chē)前草醇提物對(duì)水負(fù)荷大鼠的腎小球?yàn)V過(guò)功能有影響。江西車(chē)前草高劑量組與甘肅車(chē)前草高劑量組對(duì)CA 有明顯的抑制作用，從而造成腎小管內(nèi)H+減少，管腔中Na+的重吸收減少，最終導(dǎo)致Na+排出量增加，排尿量增加。

綜上所述，車(chē)前草醇提物具有顯著的利尿作用，且江西產(chǎn)車(chē)前草的利尿效果強(qiáng)于甘肅產(chǎn)車(chē)前草，但同等劑量下，兩者利尿作用差異不明顯。

5 展望

車(chē)前草與車(chē)前子為同一原植物的不同藥用部位，車(chē)前子作為利尿藥已大量在臨床使用。經(jīng)考證，車(chē)前草的道地產(chǎn)區(qū)位于江西贛江沿岸，但由于車(chē)前草適應(yīng)性強(qiáng)，在田間地頭隨處可見(jiàn)，甘肅也分布有一定量車(chē)前草。現(xiàn)代藥理研究表明，車(chē)前草也具有顯著的利尿作用，但作為利尿藥在臨床使用的量遠(yuǎn)不及車(chē)前子。所以，臨床上可將車(chē)前草作為利尿藥廣泛使用以擴(kuò)大藥用資源，同時(shí)，甘肅地區(qū)對(duì)車(chē)前草的規(guī)?；N植和發(fā)展也有待后期進(jìn)一步深入研究。