王 杰，張鵬鋒,2，趙小娜，張云云，魯周民*

(1.西北農(nóng)林科技大學 林學院，陜西 楊陵 712100；2.榆林市榆陽區(qū)森林防火保障中心，陜西 榆林 719000)

獅頭柑(Citrusreticulata)為蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus)亞熱帶常綠果樹，因其果皮皺起形如“獅頭”而得名[1]。獅頭柑是安康市地方名優(yōu)果品，栽培歷史悠久，主要分布在漢江、旬河沿線[2]，宋代時已在安康廣泛栽培，歷經(jīng)千年形成了獨具特色的地方栽培品種[3]。獅頭柑果樹常綠，單株產(chǎn)量高，盛果期長，果肉甘酸可口，但后味微苦，具有明神降火、生津潤肺、清熱理氣等醫(yī)療保健功效[4]。據(jù)西北農(nóng)林科技大學、農(nóng)科院校區(qū)測試中心2003年10月對旬陽獅頭柑檢測表明果實含蛋白質(zhì)0.96%、VC約0.12 mg·100g-1、Ca 147.4 mg·kg-1、P 166.9 mg·kg-1、Fe 2.31 mg·kg-1，未檢出砷、鉛、汞等有毒物質(zhì)[5]。孟瑤瑤等[6]研究了獅頭柑籽油提取技術(shù)，優(yōu)化提取工藝為：料液比1∶100(g·mL-1)，提取溫度49℃，提取時間7 h。張涵等[4]對獅頭柑果皮中的香氣進行了提取分析和鑒定，認為獅頭柑皮中香氣成分主要是烴類、醛類、酮類、醇類、酯類、芳香族化合物。獅頭柑在旬陽縣已成為全縣主導產(chǎn)業(yè)之一[7]，獅頭柑全身是寶，其根、葉、果皮均可入藥，有消食化痰、理氣養(yǎng)胃等功效，其樹體木材堅實致密，可制作優(yōu)良家具[8]。

植物源性黃酮化合物的生物活性越來越受關注[9]，其具有很好的抗炎活性、抗病毒活性[10]、抑菌性[11]、抗氧化[12]、抗過敏[13]、降血糖[14]等功效，柑橘屬的黃酮類化合物含量豐富，易分離[15]，已成為人們的研究重點之一。目前對獅頭柑的相關研究報道有良種選育技術(shù)[16]、常見蟲害防治[17]、標準化建園及高產(chǎn)栽培技術(shù)[2,18]，產(chǎn)業(yè)發(fā)展的分析與建議[17,19]，對獅頭柑的營養(yǎng)價值、保健功能和生物活性物質(zhì)的分析及資源的利用等方面研究相對較少。本研究對獅頭柑果皮的總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，為獅頭柑資源能更好的開發(fā)利用提供新思路。

試驗結(jié)果表明，獅頭柑果皮中總黃酮含量遠>果肉，故以安康獅頭柑果皮為試驗材料，采用超聲波輔助提取總黃酮，利于黃酮類化合物滲出[20-21]，通過響應面法和數(shù)理統(tǒng)計方法來優(yōu)化提取工藝，為獅頭柑的進一步利用和開發(fā)，更好地發(fā)揮其經(jīng)濟和藥用價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獅頭柑樣品采集于陜西省安康市關廟鎮(zhèn)紅專村安康北亞熱帶經(jīng)濟林果樹試驗示范站，均為隨機采摘。

主要試劑：無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，蘆丁為分析標準品，試劑均來自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

數(shù)顯卡尺，上海九量五金工具有限公司；JJ500Y型電子天平，精度0.01 g，常熟市雙杰測試儀器廠；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；R200D型電子分析天平，精度0.000 001，德國Sartorious公司；DGG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；A1330011型Beckman離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；超純水器，成都越純科技有限公司；BCD-215DC型冰箱，中國海爾集團；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；IKA-A11基本型批量式分析研磨儀，德國IKA集團；MULTISKAN-GO型全波長酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理 將所采獅頭柑樣品洗凈晾干，隨機取果實20個，分離果肉和果皮，用液氮將果皮進行速凍粉碎，所選獅頭柑應保證隨機性，分裝并標明編號，放置于-80℃冰箱中備用。

1.3.2 獅頭柑總黃酮提取的單因素試驗

1)準確稱取獅頭柑果皮樣品0.200 0 g各6份于10 mL離心管中，分別加入5 mL 75%乙醇，在超聲功率70 W，提取溫度為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下超聲提取60 min，計算總黃酮得率來確定提取溫度。

2)不同提取時間對獅頭柑總黃酮得率的影響 準確稱取獅頭柑果皮樣品0.200 0 g各6份于10 mL離心管中，分別加入5 mL 75%乙醇，在提取溫度55℃、超聲功率70 W下超聲提取20、30、40、50、60、70 min，計算總黃酮得率來確定提取時間。

3)準確稱取獅頭柑果皮樣品0.2000 g各6份于10 mL離心管中，分別加入3、5、7、9、10 mL 75%乙醇，在提取溫度55℃、提取時間30 min、超聲功率70 W下提取，計算總黃酮得率來確定料液比。

4)準確稱取獅頭柑果皮樣品0.200 0 g各6份于10 mL離心管中，加入7 mL的75%乙醇，提取溫度55℃、提取時間30 min保持不變，在超聲功率50、60、70、80、90、100 W條件下提取，計算總黃酮得率來確定超聲功率。

1.3.3 獅頭柑總黃酮提取的響應面優(yōu)化試驗 以單因素試驗的結(jié)果為依據(jù)，料液比為1∶35(g∶mL-1)，以提取溫度(A)、提取時間(B)、超聲功率(C)作為考察因子，以獅頭柑總黃酮得率(Y)為試驗指標，進行響應面試驗，因素及水平編碼見表1。

表1 獅頭柑果皮響應面試驗因素及水平編碼Table 1 Factor and levels coding of Box-Behnken Design from peel of Shitougan

1.3.4 指標測定方法

1.3.4.1 標準品的制備 蘆丁標準曲線的繪制采用應用廣泛的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[22]，但有所改動。精確稱取蘆丁標準品0.030 0 g于100 mL容量瓶中，加入一定量的75%乙醇將其溶解并定容，搖勻后即制成質(zhì)量濃度為300 μg·mL-1的蘆丁標準溶液，置于-18℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 標準曲線的繪制 取7支20 mL具塞試管依次為1～7號，用移液槍分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的蘆丁標準溶液，加一定量的75%乙醇補至3 mL，搖勻后加入1 mL 5% NaNO2于各試管中，放置6 min后加入1 mL 10% Al(NO3)3于各試管中，放置6 min后加入10 mL的1 mol·L-1NaOH溶液于各試管中，定容搖勻后靜置15 min，以空白液為參比，以蘆丁標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(X)、吸光度A為縱坐標(Y)于510 nm波長下測定吸光度，來繪制標準曲線，并計算回歸方程[4]。

1.3.4.3 樣品的測定 樣品提取方法同以上單因素試驗方法，提取后冷卻至室溫，4 500 r·min-1離心20 min，取上清液1 mL并用75%乙醇稀釋至10 mL，再吸取1 mL進行顯色，測定吸光度，按標準曲線計算其總黃酮的質(zhì)量濃度，總黃酮得率計算公式：

(1)

式中：ρn為顯色液中總黃酮的質(zhì)量濃度/μg·mL-1；V為顯色液的體積/mL；M為樣品的質(zhì)量/g；N為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用Excel2016和DPS7.55軟件對所得數(shù)據(jù)進行整理和分析，在單因素試驗基礎上按Box- Behnken組合試驗設計原理，采用Design Expert 10.0.3.1分析擬合數(shù)據(jù)并進行二次回歸響應面分析，建立多元二次響應面回歸模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 獅頭柑總黃酮提取的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對獅頭柑總黃酮得率的影響 由圖1可知，獅頭柑提取溫度為35℃時總黃酮得率最低為0.86%，隨著提取溫度的上升，總黃酮得率也增加，在55℃時為最大值2.07%，原因可能為隨著提取溫度的上升，分子熱運動逐漸加劇，超聲空化引起的湍流效應可使邊界層變薄，黃酮類化合物的傳質(zhì)速率和擴散系數(shù)增加[23]，有利于黃酮類化合物的滲出擴散；但是隨著提取溫度的繼續(xù)上升，總黃酮得率開始緩慢下降，在60℃時總黃酮得率下降到1.95%，可能由于提取溫度過高，使對熱敏感的黃酮類化合物受熱分解[24]，同時一部分乙醇揮發(fā)，造成料液比增大，黃酮類化合物提取量減少[25]，從而降低總黃酮得率。

圖1 提取溫度對獅頭柑果皮總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.1.2 提取時間對獅頭柑總黃酮得率的影響 由圖2可知，獅頭柑總黃酮得率隨提取時間的增加而增加，在提取時間為30 min時總黃酮得率為最大值2.48%，原因可能為隨著時間的增加，提取溶劑與反應物中的黃酮類化合物濃度差導致持續(xù)擴散；但隨著提取時間的繼續(xù)增加，總黃酮得率開始緩慢下降，在提取時間為60 min時，總黃酮得率下降到2.02%，可能是提取時間的過長，黃酮類化合物持續(xù)析出使?jié)舛忍荻冉档?，同時對熱敏感的黃酮類化合物水解[24]，從而降低總黃酮得率。

圖2 提取時間對獅頭柑果皮總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction duration on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.1.3 料液比對獅頭柑總黃酮得率的影響 由圖3可知，獅頭柑總黃酮得率隨著料液比的增加而增加，二者呈正相關，在料液比為1∶35(g∶mL-1)時總黃酮得率趨于穩(wěn)定為2.61%，原因可能為提取溶劑與反應物中的黃酮類化合物濃度差持續(xù)存在，使其中的黃酮類化合物持續(xù)擴散，同時加大了提取溶劑與反應物的接觸面積[26]，但隨著料液比的進一步增加，總黃酮得率增加緩慢且趨于穩(wěn)定，可能是隨著料液比的增加，使內(nèi)外滲透壓趨近穩(wěn)定，總黃酮化合物的傳質(zhì)擴散趨于穩(wěn)定狀態(tài)[27]，同時隨著提取溶劑的增加，黃酮類化合物的擴散所需時間也會增加[28]，所以在限定時間內(nèi)總黃酮得率增加緩慢，考慮到提取溶劑的增加會造成資源浪費，且對提純造成困難，所以采用料液比1∶35(g∶mL-1)最為適宜。

圖3 料液比對獅頭柑果皮總黃酮得率的影響Fig.3 Effect ofsolid-liquid ratio on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.1.4 超聲功率對獅頭柑總黃酮得率的影響 由圖4可知，獅頭柑總黃酮得率先隨著超聲功率的增加而增加，在70 W時達到最大值2.11%，原因可能為隨著超聲功率的增加，超聲空化效應產(chǎn)生的機械效應使細胞破碎充分[29]，媒介粒子的速度增大使界面擴散層上分子擴散速率增大[30]，導致黃酮類化合物擴散量和擴散速度增加；但隨著超聲功率的繼續(xù)增加，總黃酮得率開始下降，可能是超聲功率的增大會破壞某些苷體的穩(wěn)定性[31]，從而降低總黃酮得率。

圖4 超聲功率對獅頭柑果皮總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound power on yield of total flavonoids from peel of Shitougan

2.2 獅頭柑總黃酮提取的響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應面模型擬合與顯著性分析檢驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，以提取溫度(A)、提取時間(B)、超聲功率(C)為自變量，以總黃酮得率(Y)為響應值，進行Box-Benhnken試驗設計，各試驗均有17個試驗點，其中包括12個析因點、5個中心點，中心試驗均重復5次來估計純試驗誤差。

對表2進行多元回歸擬合分析，可得到二次多元回歸擬合方程：

表2 獅頭柑果皮Box-Benhnken試驗設計及結(jié)果Table 2 Results of Box-Benhnken Design from peel of Shitougan

Y=2.27+0.048×A+0.14×B+0.012×C-0.007 5×A×B+0.002 5×A×C+0.017×B×C-0.065×A2-0.25×B2-0.13×C2(R2=0.975 9)

(2)

對此模型方程進行顯著性分析檢驗(表3)，可知模型P<0.01，說明該模型差異極顯著，其模擬性良好。一次項中A的偏回歸系數(shù)顯著(P<0.05)，說明提取溫度對總黃酮得率有顯著性影響，B的偏回歸系數(shù)極顯著(P<0.01)，說明提取時間對總黃酮得率有極顯著影響，而C的偏回歸系數(shù)不顯著(P>0.05)，說明超聲功率對總黃酮得率沒有顯著影響；交互項中交互作用均不顯著；二次項中，A2對總黃酮得率影響顯著，B2、C2對總黃酮得率均有極顯著影響。該模型的回歸系數(shù)R2=0.975 9說明該模型響應值變化的97.59%來自自變量，失擬項P=0.450 9>0.05，說明該模型對自變量擬合良好，能較好地描述各自變量與響應值之間的關系。剔除回歸方程中不顯著交互項，簡化后公式為：

表3 獅頭柑果皮響應面試驗回歸模型方差分析Table 3 Anovariance analysis of regression model from peel of Shitougan

(3)

2.2.2 響應面和等高線圖分析 由圖5可知，超聲功率為70 W時，三維面陡峭、等高線呈橢圓形，說明提取溫度和提取時間的交互作用顯著，獅頭柑果皮總黃酮得率受到二者的共同影響。其中提取時間較提取溫度的三維面陡，表明提取時間對獅頭柑果皮總黃酮得率有極顯著影響。

圖5 提取溫度和提取時間交互作用對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of interaction of extraction temperature and extraction duration on yield of total flavonoids

由圖6可知，提取時間為30 min時，三維面較陡、等高線呈橢圓形，表明提取溫度和超聲功率的交互作用顯著，獅頭柑果皮總黃酮得率受到二者的共同影響。其中提取溫度較超聲功率的三維面陡，說明提取溫度對獅頭柑果皮總黃酮得率有顯著性影響。

圖6 提取溫度和超聲功率交互作用對總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of interaction of extraction temperature and ultrasound power on yield of total flavonoids

由圖7可知，提取溫度為55℃時，三維面陡峭、等高線呈橢圓形，說明提取時間和超聲功率的交互作用顯著，獅頭柑果皮總黃酮得率受到二者的共同影響。其中提取時間較超聲功率的三維面陡，說明提取時間對獅頭柑果皮總黃酮得率有極顯著影響。

圖7 提取時間和超聲功率交互作用對總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of interaction of extraction duration and ultrasound power on yield of total flavonoids

2.2.3 獅頭柑總黃酮提取參數(shù)的優(yōu)化與模型驗證 用Design-Expert 10.0.3.1對參數(shù)進一步優(yōu)化，結(jié)果表明，提取溫度60℃、提取時間32.673 min、超聲功率70.726 W，總黃酮得率為2.273%。在試驗過程中對響應面優(yōu)化結(jié)果進行了多次重復出現(xiàn)相同結(jié)果，優(yōu)化后結(jié)果低于單因素最大值，可能是由于試驗中做響應面試驗的原料是在單因素試驗后放置了一段時間，從而導致的樣品原料存在差異引起的。

綜合分析后，將優(yōu)化后參數(shù)修正為：料液比1∶35(g∶mL)、提取溫度60℃、提取時間33 min、超聲功率70 W，使用修正后參數(shù)進行試驗驗證，結(jié)果測得總黃酮得率為2.258%，與模型預測值相差較小，證明該模型可以用于分析及預測。

3 結(jié)論與討論

本研究主要為獅頭柑資源能更好的開發(fā)利用提供新思路，進一步探索獅頭柑中總黃酮的提取工藝，避免資源的浪費，為獅頭柑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供新的方法，有利于增加獅頭柑的附加值。但對提取后果皮殘渣的利用還需進一步探索，可考慮果膠、多糖和揮發(fā)油以及β-胡蘿卜素等有效成分的提取工藝研究，建立連續(xù)提取體系，對揮發(fā)油的利用可考慮羥丙基-β-環(huán)糊精包合工藝，對β-胡蘿卜素的利用可考慮微膠囊包埋技術(shù)。雖對果皮總黃酮提取工藝做了優(yōu)化，但對于所提取的總黃酮類型還不明確，需要進一步進行分離和鑒定。