李拴林，羅小燕，陳志祥，吳如月，廖 麗，丁西朋

（1. 海南大學 熱帶作物學院，?？?570288; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所，?？?571101;3. 南京農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院，南京 210095）

土地鹽漬化是當今世界環(huán)境的嚴重問題之一[1]。目前，全世界有超過10億hm2的土地因鹽堿度過高而不能被有效利用，且日益加劇，嚴重制約了全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展[2?3]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和耕地的減少，人們越來越重視對鹽堿地的開發(fā)和利用。培育耐鹽品種是利用和改良鹽堿地的有效途徑之一，耐鹽作物種質資源的篩選、鑒定與評價是開展作物耐鹽機理研究和作物耐鹽新品種培育的基礎[4]。在水稻[5]、大豆[6]、谷子[7]、辣椒[8]、海雀稗[9]和牧草[10]等作物中已開展了大量的種質資源耐鹽評價工作，并培育出了鹽豐47水稻、魯苜1號苜蓿等多個耐鹽作物新品種，且已進行了大面積的推廣示范[11?12]。木豆（Cajanus cajan）起源于印度，非洲、澳大利亞、西印度群島等熱帶、亞熱帶地區(qū)均有栽培，在全世界的種植面積約464萬hm2[13]。在我國云南、廣西、海南、江西和貴州等南方省（區(qū)）均有栽培，現(xiàn)有栽培面積約2萬hm2[14]。木豆籽含有人體必需的8種氨基酸，是世界六大食用豆類之一；木豆葉片富含蛋白，是優(yōu)質的蛋白飼料；木豆根系發(fā)達、固氮能力強，是理想的植被恢復和土壤改良樹種；木豆還具很高的藥用價值，如有清熱解毒、治療水痘、瘧疾和股骨頭壞死等疾病的功效[15]。木豆兼具生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益，其開發(fā)利用前景很大[16]。在木豆主產(chǎn)區(qū)，鹽脅迫是制約其種植的重要環(huán)境因素之一[17?18]，且不同木豆種質資源間的耐鹽性存在較大差異，為此不同木豆種質資源間的耐鹽性研究是木豆耐鹽機理研究和耐鹽新品種培育的重要基礎[19?20]。本實驗探究木豆發(fā)芽期與幼苗期的耐鹽性差異，旨在建立木豆種質資源耐鹽篩選評價體系，為開展木豆種質資源耐鹽評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料通過前期田間植物學性狀觀察，選擇植物學性狀差異較大且來源不同的5份木豆種質資源作為供試材料（表1）。挑選當年收獲的健康、均一、飽滿的木豆種子開展耐鹽脅迫實驗。

1.2 方法萌發(fā)期實驗采用培養(yǎng)皿發(fā)芽法，每皿放50粒種子，共設6個NaCl脅迫處理（0.15%、0.30%、0.60%、0.90%、1.20%、1.50%NaCl）和1個對照（CK，清水），每處理4次重復，種子均勻擺放在2層濾紙上，加入10 mL不同質量分數(shù)的NaCl，置于光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件：25 ℃光照18 h，16 ℃黑暗6 h，濕度85%。每天定時更換NaCl溶液。從第2天起每日定時調(diào)查1次發(fā)芽率，萌芽時間為6 d。實驗結束時記錄胚根和胚芽的長度。計算發(fā)芽率（GR）和發(fā)芽指數(shù)（GI）。

式中GR為發(fā)芽率；n代表正常發(fā)芽粒數(shù)；N代表供試種子數(shù)。

式中GI為發(fā)芽指數(shù)；Gt為處理后t日的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應的發(fā)芽日數(shù)。

苗期試驗采用水培法[21]。先用沙培法進行育苗，具體為木豆種子事先用1%HgCl2進行消毒，隨后將木豆種子用純凈水清洗5～6次，再將木豆種子用70 ℃水浸種5 min，靜置8 h后將木豆種子播種于用無菌水洗滌干凈且裝好沙子的育苗盤中，在室溫條件下培養(yǎng)。待子葉展開后，選擇生長狀況一致的木豆幼苗，移入1/5強度的霍格蘭營養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d，再進行NaCl脅迫處理。試驗設5個NaCl質量分數(shù)處理（0.20%、0.40%、0.60%、0.80%和1.00%NaCl）和1個對照（CK，清水），4次重復，每重復10株。實驗期間，每天下午16：00補充清水至實驗初始體積，確保培養(yǎng)液中NaCl質量分數(shù)相對穩(wěn)定。NaCl脅迫培養(yǎng)15 d后，采用直接測量法測定株高、單株根鮮質量，單株根干質量和存活株數(shù)，計算株高相對生長量（H）和存活率。用模糊數(shù)學中的隸屬函數(shù)值法對木豆資源的耐鹽性進行綜合評價。

式中，H為株高相對生長量；Ht為處理后的株高；H0為處理前的株高。

式中，Xu為隸屬函數(shù)；隸屬函數(shù)X表示所有參試材料某一指標的測量值，Xmin和Xmax分別為所有參試材料某一指標的最小值和最大值。

1.3 數(shù)據(jù)分析利用IBM SPSS 22.0軟件和Microsoft Excel 2019軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，確定不同來源木豆種質資源的耐鹽能力。以不同NaCl處理的木豆種子發(fā)芽率和幼苗存活率為自變量，NaCl處理的質量分數(shù)為因變量建立一元二次回歸方程，參考文獻[22]的方法，以木豆種子50%發(fā)芽率和幼苗50%存活率為標準分別計算萌發(fā)期和幼苗期木豆NaCl脅迫臨界值。

2 結果與分析

2.1 不同質量分數(shù)NaCl溶液對木豆種子發(fā)芽的影響

2.1.1 不同質量分數(shù)NaCl溶液對木豆種子發(fā)芽率的影響發(fā)芽率實驗結果見表2，由表2可見，5份木豆種子的發(fā)芽率隨著NaCl質量分數(shù)的增加均呈顯著下降趨勢，但不同來源的木豆種子間的發(fā)芽率下降幅度不同。在NaCl質量分數(shù)為0.15%時，除MD1的發(fā)芽率和對照沒有顯著差異外，GD1、YN1、YD1和GX1的發(fā)芽率均顯著低于對照。當NaCl質量分數(shù)為0.60%時，GD1、MD1和GX1的發(fā)芽率高于50%，YD1的發(fā)芽率低于50%，而YN1的發(fā)芽率低于30%。NaCl質量分數(shù)為0.90%時，5份木豆種子的發(fā)芽率均低于50%，YD1的發(fā)芽率降至25.23%，YN1的發(fā)芽率低至10.77%。NaCl質量分數(shù)為1.50%時，僅GX1和MD1的發(fā)芽率大于10%，GD1和YD1的發(fā)芽率僅為8.73%和8.03%，而YN1則完全不發(fā)芽。

表2 不同質量分數(shù)NaCl溶液對木豆種子發(fā)芽率的影響Tab. 2 The effect of NaCl solution with different concentrations on the germination rate of pigeonpea seeds

2.1.2 不同質量分數(shù)的NaCl溶液對木豆種子發(fā)芽指數(shù)的影響發(fā)芽指數(shù)分析結果見表3，由表3可見，隨著NaCl質量分數(shù)的提高，5份木豆種子的發(fā)芽指數(shù)總體呈下降趨勢，不同來源的木豆種子間發(fā)芽指數(shù)的下降幅度不同。NaCl質量分數(shù)為0.15%時，GD1、MD1、GX1的發(fā)芽指數(shù)與對照相比有所下降，但差異不顯著，YN1和YD1的發(fā)芽指數(shù)則顯著低于對照。NaCl質量分數(shù)為0.30%時，5份木豆種子的發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照，MD1的發(fā)芽指數(shù)為27.60，明顯高于其他4份木豆，YN1的發(fā)芽指數(shù)低于10。NaCl質量分數(shù)為0.60%時，MD1的發(fā)芽指數(shù)為22.90，YD1的發(fā)芽指數(shù)分別為10.25，GD1、GX1和YN1的發(fā)芽指數(shù)均低于10。NaCl質量分數(shù)為0.90%～1.20%時，僅MD1的發(fā)芽指數(shù)為15.83～12.53，其余4份木豆種子的發(fā)芽指數(shù)均低于10，YN1的發(fā)芽指數(shù)最低，降至2.13～0.74。當NaCl質量分數(shù)為1.50%時，MD1發(fā)芽指數(shù)為7.83，YD1、GD1和GX1的發(fā)芽指數(shù)均降至5.0以下，而YN1因不能發(fā)芽，所以發(fā)芽指數(shù)為零。

表3 不同質量分數(shù)NaCl溶液對木豆種子發(fā)芽指數(shù)的影響Tab. 3 The effect of NaCl solution with different concentrations on the germination index of pigeonpea seeds

2.1.3 不同質量分數(shù)的NaCl溶液對木豆胚根生長的影響在不同NaCl質量分數(shù)條件下對不同木豆種子的胚根長度進行測量，結果表明：木豆種子胚根生長受NaCl質量分數(shù)抑制明顯，不同木豆胚根生長受抑制程度不同（表4）。當NaCl質量分數(shù)為0.15%時，GX1和GD1的胚根長度略大于對照，但差異不顯著，而MD1、YN1和YD1的胚根長度均顯著小于對照；NaCl質量分數(shù)為0.30%時，除GX1的胚根長度和對照相當外，其他4份木豆種子的胚根長度均顯著小于對照；當NaCl質量分數(shù)達到0.60%時，5份木豆的胚根長度均顯著小于對照，木豆種子胚根的生長受到明顯抑制，其中YN1的胚根長度僅為2.20 mm；當NaCl質量分數(shù)高于0.90%時，木豆種子胚根受到嚴重抑制，生長緩慢。

表4 不同質量分數(shù)NaCl溶液對木豆胚根生長的影響Tab. 4 The effect of NaCl solution with different concentrations on the growth of pigeonpea radicle

2.1.4 不同質量分數(shù)NaCl溶液對木豆胚芽生長的影響在不同NaCl質量分數(shù)條件下對不同木豆種子的胚芽長度進行測量，結果表明：木豆種子胚芽生長受NaCl質量分數(shù)抑制作用明顯，不同木豆胚芽生長受抑制程度不同（表5）。當NaCl質量分數(shù)為0.15%時，GD1和YD1的胚芽略長于對照，GX1的胚芽略短于對照，但差異均不顯著，而MD1和YN1的胚芽則顯著短于對照，其中YN1胚芽長度僅為對照的50%；當NaCl質量分數(shù)為0.30%時，5份木豆的胚芽長度都顯著短于對照，木豆種子胚芽的生長受到明顯抑制；NaCl質量分數(shù)為0.60%～1.20%時，5份木豆的胚芽生長進一步被抑制，胚芽長度在不同NaCl質量分數(shù)之間沒有顯著差異；當NaCl質量分數(shù)為1.50%時，木豆種子胚芽受到嚴重抑制，生長緩慢。

表5 不同質量分數(shù)NaCl溶液對木豆胚芽生長的影響Tab. 5 The effect of NaCl solution with different concentrations on the growth of pigeonpea plumule

2.2 不同質量分數(shù)的NaCl溶液對木豆幼苗生長的影響

2.2.1 不同質量分數(shù)的NaCl溶液對木豆幼苗根生長的影響通過水培試驗，在不同NaCl質量分數(shù)條件下測定木豆幼苗根的鮮質量和干質量，結果表明，NaCl脅迫對木豆幼苗根生長顯著抑制，根鮮質量和干質量均隨著NaCl質量分數(shù)的增加不斷減?。ū?）。當NaCl質量分數(shù)為0.20%時，GX1和MD1木豆單株根鮮干質量均有所下降，但和對照相比差異不顯著，GD1、YD1和YN1的單株根鮮、干質量均顯著低于對照；當NaCl質量分數(shù)為0.40%時，5份木豆單株根鮮質量均顯著低于對照，除MD1單株根干質量與對照差異不顯著，其他4份單株根干質量均顯著低于對照。當NaCl質量分數(shù)大于0.60%時，5份木豆單株根鮮、干質量均顯著低于對照，根生長嚴重受抑制。

表6 NaCl脅迫對木豆幼苗根生長的影響Tab. 6 The effect of NaCl stress on the root growth of pigeonpea seedlings

2.2.2 不同質量分數(shù)的NaCl溶液對木豆幼苗株高相對生長量的影響木豆幼苗株高相對生長量分析結果（表7）表明，NaCl脅迫對木豆幼苗地上部生長顯著抑制，株高相對生長量隨著NaCl質量分數(shù)增加顯著降低。當NaCl質量分數(shù)為0.20%～0.40%時，5份木豆幼苗地上部生長緩慢，其株高相對生長量均顯著低于對照；當NaCl質量分數(shù)為0.60%時，MD1、GX1和GD1幼苗地上部緩慢生長，YD1和YN1幼苗地上部生長完全被抑制，株高相對生長量為零；當NaCl質量分數(shù)為0.80%時，MD1和GX1幼苗地上部仍緩慢生長，而GD1、YD1和YN1幼苗地上部生長完全被抑制，株高相對生長量為零；當NaCl質量分數(shù)為0.80%時，5份木豆幼苗株高相對生長量均為零，地上部生長完全被抑制。

表7 NaCl脅迫對木豆幼苗株高相對生長量的影響Tab. 7 The effects of NaCl stress on relative growth of plant height of pigeonpea seedlings

2.2.3 不同質量分數(shù)的NaCl溶液對木豆幼苗存活率的影響木豆幼苗存活率分析結果（表8）表明，隨NaCl質量分數(shù)增加木豆幼苗存活率顯著降低，不同木豆成活率下降幅度差異較大。當NaCl質量分數(shù)為0.20%時，5份木豆幼苗的存活率均顯著下降，但MD1和GX1的存活率下降相對較小，YD1的存活率下降最大，降至50.33%左右；當NaCl質量分數(shù)為0.40%時，5份木豆幼苗的存活率均進一步下降，YD1和YN1幼苗的存活率分別降至25.20%和35.53%，其他幼苗的存活率在58%以上；當NaCl質量分數(shù)為0.60%時，MD1、GX1和GD1幼苗存活率均降至35%左右，YN1的存活率僅為5.07%左右，而YD1則全部死亡；當NaCl質量分數(shù)為0.80%時，MD1幼苗存活率降至15.73%，GX1和GD1的存活率分別僅為6.93%和5.73%，YD1和YN1幼苗則全部死亡；當NaCl質量分數(shù)為1.00%時，5份木豆幼苗均全部死亡。

表8 NaCl脅迫對木豆幼苗成活率的影響Tab. 8 The effect of NaCl stress on the survival rate of pigeonpea seedlings

2.3 木豆耐鹽性綜合評價對種子萌發(fā)期的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚根長度和胚芽長度及幼苗期的單株根鮮質量、單株根干質量、株高相對生長量和成活率進行隸屬函數(shù)分析 (表9，表10)。通過對隸屬均值的比較可以得出在萌發(fā)期5份不同來源木豆種子的耐鹽能力依次為MD1>GX1>YD1>GD1>YN1，幼苗期的耐鹽能力依次為MD1>GX1>GD1>YD1>YN1，MD1和GX1為耐鹽種質，YD1和YN1為鹽敏感種質。

表9 木豆種子萌發(fā)期耐鹽性綜合評價Tab. 9 Comprehensive evaluation of salt tolerance of pigeonpea seeds at the germination stage

表10 木豆幼苗期耐鹽性綜合評價Tab. 10 Comprehensive evaluation of salt tolerance of pigeonpea at the seedling stage

2.4 木豆NaCl溶液脅迫臨界值通過建立一元二次回歸方程計算木豆萌發(fā)期及幼苗期NaCl脅迫臨界值（表11）。萌發(fā)期以50%發(fā)芽率為標準，確定5份木豆種子NaCl脅迫臨界質量分數(shù)值范圍為0.377%～0.748 %，平均為0.605%。不同木豆種子的NaCl脅迫臨界值不同，其中GX1和MD1種子的臨界值較大，分別為0.748%和0.744%，YN1種子的臨界值最小。幼苗期以50%存活率為標準，確定5份木豆幼苗NaCl脅迫臨界值為0.275%～0.510 %，平均為0.420%。不同木豆幼苗的NaCl脅迫臨界值差異較大，其中MD1和GX1幼苗的臨界值較大，分別為0.510%和0.481%，YD1和YN1幼苗的臨界值較小，分別為0.275%和0.371%。

表11 木豆NaCl脅迫臨界質量分數(shù)的確定Tab. 11 Determination of critical concentration of NaCl stress for pigeonpea accessions

3 討 論

植物的耐鹽性是隨發(fā)育時期而變化的，其中種子萌發(fā)期和幼苗期是對鹽分最敏感時期，因此，在種質資源耐鹽性篩選評價時一般選擇在這2個時期進行[23]。本研究結果顯示，5份不同來源木豆種質資源在萌發(fā)期不同質量分數(shù)NaCl處理下的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚根長度和胚芽長度均隨NaCl質量分數(shù)的增大而減小，這與相關研究結果[20]基本一致。當NaCl質量分數(shù)為0.60%時，木豆種子萌發(fā)相關的各項指標均急劇下降，且在不同木豆種質間表現(xiàn)出顯著差異。以50%發(fā)芽率為標準，通過回歸方程計算出5份木豆種子萌發(fā)期的NaCl脅迫臨界質量分數(shù)值為0.605%，而在幼苗期，5份不同來源木豆種質資源在不同NaCl質量分數(shù)處理下的單株根鮮/干質量、株高相對生長量和存活率均隨NaCl質量分數(shù)的增大而減小。當NaCl質量分數(shù)為0.40%～0.60%時，木豆幼苗的各項指標均急劇下降，且在不同木豆種質間表現(xiàn)出顯著差異。以50%存活率為標準，通過回歸方程計算出木豆幼苗NaCl脅迫臨界質量分數(shù)值0.420%。因此，0.605% 、0.420%NaCl分別為種子萌發(fā)期和幼苗期開展木豆耐鹽性評價的適宜質量分數(shù)。

植物的耐鹽性狀為多基因控制的數(shù)量性狀，不同耐鹽基因的表達時期存在差異，所以不同發(fā)育時期植物的耐鹽性也存在差異[24]。本研究通過觀測不同NaCl脅迫處理對5份不同來源木豆種子發(fā)芽及幼苗生長的影響，采用隸屬函數(shù)法對木豆種質資源進行耐鹽性綜合評價發(fā)現(xiàn)，在不同時期5份木豆種質資源的耐鹽能力強弱順序并不完全一致，這可能是由于木豆不同生長發(fā)育階段的耐鹽性受不同的耐鹽基因調(diào)控。這與小麥[25]、番茄[26]、黃瓜[27]、豇豆[28]等多種作物種質資源在種子萌發(fā)期和幼苗期耐鹽性存在差別的結果類似。如董志剛等[26]發(fā)現(xiàn)在芽苗期和幼苗期耐鹽和中等耐鹽番茄材料相同率為53.85%；方先文等[29]發(fā)現(xiàn)芽期耐鹽水稻品種在苗期耐鹽性較差，而篩選出的苗期極端耐鹽水稻品種在芽期受到高質量分數(shù)鹽溶液的極顯著抑制。所以, 在進行作物種質資源耐鹽性評價篩選時, 要以多個生長發(fā)育階段鑒定結果作為耐鹽依據(jù)才能真實反映其耐鹽能力。

本研究的5份木豆種質資源在不同質量分數(shù)NaCl溶液處理下的種子萌發(fā)特性和幼苗生長狀況，采用隸屬函數(shù)法鑒定出耐鹽木豆種質MD1和GX1，鹽敏感種質YN1。確定不同來源木豆種子萌發(fā)期和幼苗期NaCl脅迫臨界值分別為0.377%～0.748%和0.275%～0.510%。