李 梅，李白嘉，黨永輝，高成閣

（1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科，陜西西安 710061；2.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院，陜西西安 710100；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061）

童年時(shí)期情感或身體上的不良經(jīng)歷，包括虐待、忽視、創(chuàng)傷等會(huì)增加精神病的患病風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。目前生命早期不良應(yīng)激的研究主要集中于動(dòng)物模型，早期社會(huì)隔離模型（social isolation,SI）是最常使用的動(dòng)物模型。SI對成年后的行為產(chǎn)生重要影響，嚙齒類動(dòng)物可出現(xiàn)抑郁行為、焦慮行為、前脈沖抑制受損、認(rèn)知功能改變等[3-6]。SI不僅影響行為表型，也顯著影響腦內(nèi)多巴胺、五羥色胺、谷氨酸等神經(jīng)化學(xué)功能[7]。這些改變與精神分裂癥具有密切關(guān)系。為進(jìn)一步研究早期SI與精神分裂癥的關(guān)系，本研究通過建立早期SI模型，并應(yīng)用非典型抗精神病藥利培酮和典型抗精神病藥氟哌啶醇對模型進(jìn)行干預(yù)，探究藥物對C57小鼠的行為表型及生化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組3周齡C57清潔級小鼠（雄鼠，每組8只，共32只），購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。室溫(23±1)℃，濕度55%±5%，光照時(shí)間為7：00~19：00。動(dòng)物自由獲取水和食物。適應(yīng)3 d后，小鼠隨機(jī)分為群養(yǎng)(group house,GH)組和隔離(social isolation,SI)組，SI小鼠單籠飼養(yǎng)，GH組小鼠3~4只/籠。隔離至8周后，分別等體積腹腔注射生理鹽水（normal saline,NS）、利培酮（risperidone,RIS）、氟哌啶醇(haloperidol,HA)。小鼠分為4組：對照組（GH+NS）、模型組（SI+NS）、利培酮干預(yù)組（SI+RIS）、氟哌啶醇干預(yù)組（SI+HA）。對照組與模型組結(jié)果對比可預(yù)測模型是否建立成功，干預(yù)組與模型組結(jié)果對比則可預(yù)測利培酮和氟哌啶醇的干預(yù)效果。利培酮和氟哌啶醇的劑量分別為0.1、0.2 mg/kg。連續(xù)干預(yù)14 d后，進(jìn)行行為學(xué)測試，期間給藥不間斷。與實(shí)驗(yàn)鼠周齡、體質(zhì)量相當(dāng)?shù)腃D1雄鼠16只，用于社會(huì)互動(dòng)測試（social interaction test,SIT）中的陌生鼠。

1.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.1曠場實(shí)驗(yàn)（open field test,OFT）裝置為一個(gè)正方體（45 cm×45 cm×45 cm）的黑色敞箱。實(shí)驗(yàn)時(shí)，適應(yīng)測試環(huán)境后使小鼠自由探索1 h。用電腦自動(dòng)控制下的視頻追蹤系統(tǒng)（SMART，Panlab SL，Barcelona，Spain）監(jiān)測動(dòng)物的自主活動(dòng)。評價(jià)小鼠的自主活動(dòng)能力和焦慮樣行為。

1.2.2高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze test,EPMT)裝置包括兩個(gè)交叉的開臂（25 cm×5 cm）和兩個(gè)上部敞開的閉臂（25 cm×5 cm×20 cm），中心為正方形的開闊平臺(tái)（5 cm×5 cm）。實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠面對開臂置于中央平臺(tái)，分別記錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)和在兩臂滯留時(shí)間，計(jì)算百分比，以此作為評價(jià)焦慮的指標(biāo)。

1.2.3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test,FST)裝置為一透明有機(jī)玻璃桶（直徑25 cm×高15 cm），水溫恒定（22±1）℃，水深10 cm，小鼠后爪和尾不能觸及水底。將小鼠放入水中，記錄小鼠6 min的累計(jì)漂浮不動(dòng)時(shí)間。評價(jià)小鼠的抑郁樣行為。

1.2.4筑巢實(shí)驗(yàn)(nest building test,NST)測試前一天將每只小鼠單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)24 h。當(dāng)日18：00，即黑暗期之前1 h，將小鼠轉(zhuǎn)移至一個(gè)新籠子里，底部平鋪(10±1)g的干凈墊料，籠子一側(cè)放置5 g脫脂棉球作為筑巢材料。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中將籠子保持在房間原有的位置。次日上午8時(shí)，由未參加測試的5人盲評每只小鼠筑巢分?jǐn)?shù)，以代表SI組小鼠和GH組小鼠的筑巢能力。評分等級如下。0分：棉球未被移動(dòng)；1分：棉球散落在籠子四處，但沒有明顯的撕咬痕跡；2分：棉球主要集中在籠子的一角，但沒有明顯的咬痕；3分：棉球主要集中在籠子一角且有明顯撕咬痕跡，但沒有可見的巢；4分：棉球主要集中在籠子一角且有明顯撕咬痕跡，同時(shí)可見明顯的巢。評價(jià)小鼠的社會(huì)退縮行為。

1.2.5社會(huì)互動(dòng)測試（social interaction test,SIT）測試前，雄性原住小鼠在測試籠中單獨(dú)飼養(yǎng)2 d，測試時(shí)另外放入一只CD1陌生小鼠5 min，記錄行為反應(yīng)，包括：①社會(huì)交往行為，如緊隨（close following）、審視（inspection）、嗅聞生殖器（anogenital sniffing）等；②逃避行為（主動(dòng)回避另一只小鼠）；③攻擊行為（撕咬、扭打、抖動(dòng)尾巴）。評價(jià)小鼠的社會(huì)活動(dòng)行為。

1.2.6新異物體辨別實(shí)驗(yàn)(novel object recognition test,NORT)實(shí)驗(yàn)裝置為一敞箱（30 cm×30 cm×35 cm），底部覆蓋飼養(yǎng)墊料。適應(yīng)階段（Day1）：小鼠自由探索裝置10 min。訓(xùn)練階段（Day2）：將兩個(gè)形狀、顏色不同但大小相近的物體對稱固定于敞箱底部中心，允許小鼠探索10 min，記錄小鼠探究每一新異物體（面對、觸或嗅）的時(shí)間；1 h后，換掉其中一個(gè)物體，將動(dòng)物再次放入測試箱自由探索5 min，記錄小鼠探究每個(gè)新異物體的時(shí)間，以此評價(jià)小鼠的認(rèn)知能力。

1.2.7前脈沖抑制實(shí)驗(yàn)(prepulse inhibition,PPI)實(shí)驗(yàn)儀器為震驚反射系統(tǒng)（Startle Reflex，Med Asso?ciates Inc,USA）。實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠在實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)適應(yīng)5 min。背景聲音是68 dB，共86個(gè)試驗(yàn)。8種試驗(yàn)類型，分別是單獨(dú)的驚反射刺激（pulse-alone,120 dB，持續(xù)40 ms）、3種單獨(dú)的前脈沖刺激（prepulse-alone，分別高于背景聲音3、6、12 dB，持續(xù)20 ms）、3種前兩類刺激聯(lián)合的試驗(yàn)（pulse+prepulse，二者間隔100 ms）和只給予背景聲音的無刺激試驗(yàn)（no stimulus）。這8種類型的試驗(yàn)以假隨機(jī)的方式出現(xiàn),每種試驗(yàn)呈現(xiàn)10次，每個(gè)試驗(yàn)間的平均間隔為15 s（8~22 s）。此外，整個(gè)測試開始有6個(gè)單獨(dú)的驚反射刺激（結(jié)果不納入分析），用以將動(dòng)物的初始反應(yīng)降低到一個(gè)平臺(tái)水平。評價(jià)小鼠感覺門控系統(tǒng)功能。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immuno?sorbent assay,ELISA)實(shí)驗(yàn)采用雙抗一步夾心法，預(yù)包被抗體的微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)記HRP的抗體。經(jīng)過溫浴后，徹底洗滌。底物TMB顯色，在過氧化物酶的作用下催化為藍(lán)色，隨后酸化后變?yōu)辄S色。顏色深淺與樣本的濃度呈正相關(guān)。利用酶標(biāo)儀設(shè)定450 nm波長，測定吸光度值（A值），計(jì)算樣本濃度。檢測腦組織中D2R、NR1的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS statistics 24.0進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組間比較應(yīng)用最小顯著性差異法LSD(least-significant difference)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

2.1.1對自主活動(dòng)和焦慮-抑郁樣行為的作用在OFT中，4組小鼠的總活動(dòng)距離沒有差異（圖1A）。與GH組相比，SI組小鼠中心區(qū)域活動(dòng)距離明顯減少；與SI組相比，SI+RIS組小鼠中心區(qū)域活動(dòng)距離明顯增加（P＜0.05，圖1B）。

圖1 OFT結(jié)果Fig.1 OFT results

在EPMT中，與GH組比較，SI組小鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)明顯減少（P＜0.05，圖2A）。與SI組比較，SI+RIS組小鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)明顯增加（P＜0.05，圖2A），SI+RIS組在開臂中的時(shí)間明顯增加（P＜0.05，圖2C）。與SI+RIS組相比，SI和SI+HA組小鼠在閉臂停留時(shí)間明顯增加（P＜0.05，圖2D）。

在FST中，SI組小鼠首次出現(xiàn)不動(dòng)行為的潛伏時(shí)間明顯低于SI+RIS組小鼠（P＜0.05，圖2E）；與GH組比較，SI組小鼠的后4 min不動(dòng)時(shí)間均明顯增加（P＜0.05，圖2F）。

同時(shí)與SI組比較，SI+RIS和SI+HA組小鼠 的后4 min不動(dòng)時(shí)間均明顯減少（P＜0.05，圖2F）。

2.1.2對筑巢能力和社會(huì)行為的作用NBT中，與GH組比較，SI組小鼠的筑巢能力明顯下降。而SI+RIS組小鼠的筑巢能力明顯高于SI組（P＜0.05，圖3A）。SIT實(shí)驗(yàn)中，與GH組比較，SI組和SI+HA組的社會(huì)互動(dòng)行為和逃避行為明顯下降（P＜0.05，圖3B、圖3C）。4組小鼠的攻擊行為無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3D）。

2.1.3對認(rèn)知能力的作用NORT中，各組小鼠對物體的偏好無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3E、圖3F）。

圖2情緒相關(guān)行為結(jié)果Fig.2 Emotional-related behavioral outcomes

2.1.4對PPI的作用PPI實(shí)驗(yàn)中，與GH組相比，SI組小鼠的PPI指數(shù)明顯降低；SI+RIS組和SI+HA組 小 鼠 的PPI指 數(shù) 明 顯 高 于SI組（P＜0.05，圖4A）。

圖4 PPI實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 PPI experimental results

2.2 對PFC、NAc中D2R和NR1的作用與GH組比較，模型組SI的NR1在PFC中明顯下降（P＜0.05，圖5B），D2R在NAc中明顯升高（P＜0.05，圖5C）。利培酮和氟哌啶醇干預(yù)后，SI+RIS和SI+HA組小鼠NAc中的D2R濃度降低（P＜0.05，圖5C），PFC中的NR1濃度與SI組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異消失。

圖5 D2R和NR1表達(dá) 結(jié)果Fig.5 Expressions of D2R and NR1

3 討 論

精神分裂癥是一組病因未明的重性精神病，臨床上往往表現(xiàn)為癥狀各異的綜合征，涉及感知覺、思維、情感和行為等多方面的障礙，以及精神活動(dòng)的不協(xié)調(diào)[8]。其發(fā)病機(jī)制迄今尚不明確。多巴胺2型受體（dopamine type 2 receptor,D2R）和谷氨酸N-甲基天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate acid receptor,NMDAR）的功能失調(diào)占據(jù)主流學(xué)說，受到科研工作者的關(guān)注[9-10]。典型的抗精神病藥包括氟哌啶醇等，具有多巴胺功能拮抗作用，便支持此學(xué)說。利培酮作為非典型抗精神病藥，不僅具有D2R拮抗作用，也與5-HT2受體具有較高的親和力，臨床上不良反應(yīng)更小。本研究利用SI模型，從情緒、認(rèn)知、社會(huì)行為、感覺門控等方面，全面探討利培酮和氟哌啶醇干預(yù)SI的不同機(jī)制。

3.1 利培酮與氟哌啶醇相比，能更好地改善SI引起的精神分裂樣行為表型本研究中，SI小鼠與對照組相比，表現(xiàn)精神分裂樣行為表型，模型建立成功。首先，SI組小鼠出現(xiàn)情緒異常。OFT的中心區(qū)域活動(dòng)距離、EPMT、FST均可有效評價(jià)動(dòng)物的情緒行為。本研究表明，利培酮可以緩解SI引起的焦慮和抑郁樣行為，氟哌啶醇只能減少抑郁樣行為。其次，SI小鼠的筑巢能力、社會(huì)交往行為明顯減少，出現(xiàn)社會(huì)退縮。筑巢行為是小鼠的本能行為，具有社會(huì)交流性質(zhì)，筑巢能力的受損表明小鼠社會(huì)功能損傷，這與LI等[11]研究結(jié)果相同。SIT是從小鼠不同的行為表現(xiàn)評價(jià)其社會(huì)交往、逃避及攻擊行為，只有利培酮對社會(huì)行為有較好的干預(yù)結(jié)果。SI小鼠在NORT中并未表現(xiàn)出認(rèn)知功能改變，與Morris水迷宮中SI小鼠空間記憶能力下降結(jié)果不一致，這可能與評價(jià)認(rèn)知功能所采用的測量方法不同有關(guān)[12]。但SI小鼠的PPI認(rèn)知功能下降。PPI被認(rèn)為是一種跨種系的感覺運(yùn)動(dòng)門控模型，可以作為一種注意前的感覺門控測量方法，感覺門控功能的缺失與精神分裂癥患者所表現(xiàn)出的認(rèn)知混亂和思維異常有密切的關(guān)系[13-14]。因此，感覺門控功能缺失可用于間接評價(jià)精神分裂癥?；谏窠?jīng)發(fā)育學(xué)說的SI模型使小鼠表現(xiàn)出精神分裂癥相關(guān)的行為表型，這表明SI作為精神分裂癥模型,具有較好的結(jié)構(gòu)效度、表面效度和預(yù)測效度，相比氟哌啶醇，利培酮能更好地改善焦慮樣行為、社會(huì)退縮、社會(huì)互動(dòng)行為和逃避行為。

圖3社會(huì)行為和認(rèn)知行為結(jié)果Fig.3 Results of social behavior and cognitive behavior

3.2 利培酮和氟哌啶醇影響SI引起的D2R、NR1表達(dá)異常在本研究中，早期SI應(yīng)激的小鼠，其PFC中NR1表達(dá)下降，NAc中D2R的表達(dá)升高，這與現(xiàn)有的精神分裂癥的主流假說相一致，即皮質(zhì)NMDA受體功能下降，而皮質(zhì)下邊緣系統(tǒng)D2R功能活躍[9-10]。利培酮和氟哌啶醇干預(yù)后，SI+HA小鼠中D2R表達(dá)與SI組比較明顯降低，NR1的表達(dá)雖未出現(xiàn)改變，但相對于GH組的明顯差異消失?，F(xiàn)有動(dòng)物研究顯示，早期SI能引起DA系統(tǒng)濃度和功能的改變，這種改變主要發(fā)生在PFC、NAc和杏仁核[15-16]。這與本研究發(fā)現(xiàn)的SI小鼠出現(xiàn)NAc中D2R的表達(dá)上調(diào)一致。IERA?CI等[4]發(fā)現(xiàn)，社會(huì)隔離小鼠前額葉皮層mGluR1和mGluR2的水平選擇性下降。另有研究發(fā)現(xiàn)，社會(huì)隔離26 d后，大鼠內(nèi)側(cè)前額葉mGluR6和AMPA3型谷氨酸受體亞基增加[17]。本研究中SI小鼠PFC中NR1的表達(dá)下調(diào)，并表現(xiàn)出類似情緒障礙。SI小鼠的行為表型異常與腦內(nèi)D2R、NR1的表達(dá)異常相關(guān)。

利培酮和氟哌啶醇顯著影響D2R表達(dá)，對NR1表達(dá)也有一定影響。有學(xué)者認(rèn)為，精神分裂癥的發(fā)生是源于D2R調(diào)節(jié)作用于NMDA受體的谷氨酸釋放狀況而造成谷氨酸NMDA受體功能減退的結(jié)果[18]。他們認(rèn)為是遺傳性的DA系統(tǒng)異常帶來谷氨酸分泌的超抑制，引起NMDA受體功能減退，進(jìn)而形成精神病性癥狀。因而一旦給予精神分裂癥患者D2R阻滯劑時(shí)，則可恢復(fù)正常的谷氨酸分泌，解除其NMDA受體功能減退狀態(tài)而使精神癥狀得到控制（這也可能是D2R阻滯劑治療精神病性癥狀的療效機(jī)制所在）[19]。多巴胺受體與NMDA受體相互作用，在人類皮層和嚙齒動(dòng)物紋狀體中D1受體介導(dǎo)NMDAR反應(yīng)的增強(qiáng)[20-21]，這種調(diào)節(jié)在伏隔核、前額皮層等大腦其他結(jié)構(gòu)也得到證實(shí)[22-23]。同時(shí)在海馬CA1錐體神經(jīng)元，D2R抑制NMDA受體介導(dǎo)的興奮傳導(dǎo)，這可能是通過激活Ca2+通道，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，Ca2+內(nèi)流減少，NMDAR應(yīng)答減弱[24]；前額葉皮層神經(jīng)元也發(fā)現(xiàn)D2R抑制NMDA受體介導(dǎo)的下游活性[25]。因此，利培酮和氟哌啶醇在抑制D2R發(fā)揮抗精神病作用時(shí)，可能也影響著NMDA受體的功能。

綜上所述，相比氟哌啶醇，利培酮能更好地干預(yù)SI誘導(dǎo)的精神分裂樣行為，同時(shí)這可能是通過D2R、NR1發(fā)揮作用。