郭池華，王 湘，劉 煥，趙 妍，郭玉芳，王 爽，王文濤

（1.西安醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，陜西西安 710021；2.西安紅會醫(yī)院脊柱外科，陜西西安 710054）

骨癌痛（bone cancer pain,BCP）嚴重影響著腫瘤患者的身心健康。由于臨床治療手段的局限，大量患者的病情無法得到妥善治療[1]。因此，研究其發(fā)生發(fā)展機制，尋找潛在治療靶點以提高患者生活質量是亟待解決的關鍵臨床問題[2]。微小RNA（microRNA,miRNA）是一種調控型非編碼RNA，因其特殊的生物學效應已引起廣泛關注。其主要作用是通過互補結合靶mRNA 3’非編碼區(qū)（untranslated region,UTR）端，調控靶mRNA降解或抑制翻譯，而最終在轉錄后水平產生負調控效應[3-4]。

組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 6，HDAC6）是組蛋白去乙酰化酶家族中最為特殊的一員，可影響細胞質中非組蛋白的功能[5]。目前研究發(fā)現，其在神經系統(tǒng)疾病尤其在痛覺產生、維持以及神經免疫炎癥方面發(fā)揮著關鍵調節(jié)作用[6-7]。文獻報道，在化療引起的神經損傷小鼠模型中出現痛行為學反應，且采用HDAC6特異性阻斷劑ACY-1215進行干預后，痛行為反應明顯改善[8]。

已有多項研究證實了miR-362的負向調控作用，且均來自腫瘤相關研究[9-10]。據此推測，在BCP大鼠模型中miR-362也應有一定的鎮(zhèn)痛效應，并且可能是通過靶向調控HDAC6而實現。因此，本研究觀察miR-362對BCP大鼠的鎮(zhèn)痛效應并探討其作用機制，為臨床鎮(zhèn)痛靶點的選擇提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞及主要試劑雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠由成都達碩實驗動物有限公司提供，體質量180~200 g大鼠用于造模，體質量80~100 g大鼠用于腹腔培養(yǎng)Walker 256乳腺癌細胞。實驗動物均飼養(yǎng)于標準透明塑料飼養(yǎng)籠中，室溫（22~25）℃，自由攝食飲水，保證12 h/12 h正常晝夜節(jié)律。所有動物實驗均嚴格遵守西安醫(yī)學院動物倫理委員會的要求，盡可能減少動物使用數量和所遭受痛苦。

HEK-293T細胞和Walker 256細胞均在含有100 mL/L胎牛血清（美國Gibco公司）和10 mL/L青霉素/鏈霉素（美國Gibco公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）中于37℃50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)HEK-293 T細胞（美國ATCC公司）用于驗證miR-362和HDAC6的上下游關系。

Trizol試劑及逆轉錄、實時熒光定量PCR（quantita?tive real-time PCR，qRT-PCR）試 劑 盒 以 及Lipo?fectamine 2000試劑盒購自日本TaKaRa公司。miR-362引物、模擬物（mimic miR-362）和無義序列（mimic miR-NC）、野生型HDAC6 3’UTR（HDAC6 3’UTRWT）及突變型HDAC6 3’UTR（HDAC6 3’UTRMUT）熒光報告質粒購自廣州賽誠生物有限公司。HDAC6引物以及HDAC6 siRNA由武漢博士德生物公司提供。兔抗大鼠HDAC6抗體購于英國Abcam公司，兔抗大鼠核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）p65抗體購于美國CST公司，小鼠抗大鼠β-actin抗體購于美國Sigma公司。

1.2 BCP大鼠模型的建立將培養(yǎng)的Walker 256細胞先注射于體質量為80~100 g大鼠腹腔中進行預適應，隨后待大鼠腹部隆起后，吸取腹水并調節(jié)細胞密度為2×106個/mL用于造模。大鼠麻醉后仰臥位固定于手術臺[11]。在右脛骨中上1/3處備皮并消毒皮膚，于脛骨結節(jié)周圍做5 mm切口，暴露脛骨。用1 mL注射器針頭在脛骨平坦面打孔，出現落空感后拔出針頭，可見骨髓流出。用20 μL微量注射器向骨髓 腔 內 注 射10 μL的2×106個/mL的Walker 256細胞懸液，制作BCP模型。最后退出針頭，骨蠟封針孔，待大鼠蘇醒后放回鼠籠。

1.3 鞘內置管BCP大鼠麻醉并俯臥位固定于手術臺。在胸腰段正中位置做2 cm切口。分離脊柱兩旁肌肉暴露棘突，保持過屈體位在棘突下插入PE-10導管，導管突破硬膜時鼠尾輕微擺動，注意不要損傷脊髓。插入深度為T8至L3位置。導管的另一端通過皮下隧道于兩耳中間穿出用于鞘內給藥。置管完成后檢查大鼠后肢活動情況以證明脊髓是否完好，如有異常證明置管失敗。

1.4 實驗分組及給藥動物實驗：60只大鼠均分為6組，分別為Sham組（骨髓腔僅注射生理鹽水）、BCP組（骨髓腔僅植入腫瘤細胞）、BCP+LV-NC組（BCP大鼠鞘內注射LV-NC）、BCP+LV-miR-362組（BCP大鼠鞘內注射LV-miR-362）、BCP+LV-miR-362+LV-HDAC6組（BCP大鼠鞘內注射LV-miR-362和HDAC6過表達質粒）和BCP+LV-HDAC6 siRNA組（BCP大鼠鞘內注射HDAC6 siRNA）。大鼠出現甩尾表明注射成功。實驗具體過程如圖1所示。依據本課題組之前實驗[11]，BCP大鼠痛行為變化于腫瘤細胞植入術后14 d達到高峰，故建模后14 d確定為干預時間起點。第1~第3天連續(xù)鞘內注射相應干預劑，并于第1~第7天每天檢測行為學變化，第7天處死大鼠進行qRT-PCR、Western blotting和ELISA檢測。

圖1實驗流程圖Fig.1 Experimental procedures

細胞實驗：HEK-293 T細胞分為4組，mimic miR-362+HDAC6 3’UTRMUT組共轉染mimic miR-362質 粒 和HDAC6 3’UTRMUT質 粒，mimic miR-362+HDAC6 3’UTRWT組 共 轉 染mimic miR-362質 粒 和HDAC6 3’UTRWT質 粒，mimic miR-NC+HDAC6 3’UTRMUT組 共轉染mimic miR-NC質 粒 和HDAC6 3’UTRMUT質 粒，mimic miR-NC+HDAC6 3’UTRWT組 共 轉 染mimic miR-NC質 粒 和HDAC6 3’UTRWT質粒。48 h后雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定各組熒光素酶活性。

1.5 行為學測定使用Van Frey纖維絲檢測大鼠的機械痛敏。大鼠放入底部鏤空的透明有機玻璃盒后，使用一系列Van Frey纖維絲（美國Stoelting公司，規(guī)格為1、2、4、6、8、10、15、26 g）。刺激大鼠右后肢足底中部的皮膚，用機械縮足閾值（paw withdraw?al threshold,PWT）表示機械痛敏。

使用熱痛刺激儀檢測大鼠熱痛敏。熱痛刺激儀刺激大鼠右后肢足底中部皮膚，若大鼠抬腳回避，則停止刺激記錄時間，為熱縮組潛伏期（paw withdraw?al latcncy,PWL），以表示熱痛敏。設置熱量強度使正常大鼠PWL為16 s。為了防止大鼠被燙傷，熱痛刺激儀切斷時間設置為20 s。其判定方法和記錄方法參照本課題組文獻報道的方式進行[11]。

1.6 qRT-PCR檢測在Sham組、BCP組、BCP+LV-NC組和BCP+LV-miR-362組中分別取3只大鼠處死，取脊髓腰膨大部分組織放入RNAse-free離心管中加入Trizol充分勻漿后按照說明提取總RNA。在檢測miR-362表達時，采用組織miRNA提取試劑盒分離出miR-362，采用加尾法將RNA反轉錄成cDNA，以U6為內參，用2-ΔΔCt法計算miR-362的相對表達量；在檢測HDAC6 mRNA時，以GAPDH為內參，同法計算HDAC6 mRNA的相對表達量。qRT-PCR引物見表1。

表1 qRT-PCR中各基因引物序列Tab.1 Primers for RT-PCR

1.7 Western blotting檢測在sham組、BCP組、BCP+LV-NC組、BCP+LV-miR-362組 和BCP+LV-HDAC6 siRNA組中各取3只大鼠處死，取出脊髓腰膨大處組織，然后加入1 mL混有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，勻漿裂解離心取上清。依照BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量。制備SDS-PAGE凝膠對蛋白樣品進行電泳，然后用PVDF膜將凝膠進行轉膜后，用50 mL/L脫脂牛奶粉封閉，在4℃將PVDF膜于稀釋的一抗（HDAC6、NF-κB p65為1∶1 000，β-actin為1∶5 000）中反應過夜，經TBST洗膜3次后，加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶二抗于37℃孵育1 h。最后滴加ECL化學發(fā)光液，進行曝光成像，以β-actin為內參，對條帶進行灰度定量分析，計算目的蛋白的相對表達情況。

1.8 ELISA檢測在sham組、BCP組 和BCP+LV-HDAC6 siRNA組中各取3只大鼠處死，取出脊髓腰膨大處組織，利用ELISA試劑盒（美國R&D公司）檢測各組脊髓的白細胞介素（interleukin）-1β、IL-6和TNF-α水平。具體步驟按照實驗說明書進行操作。

1.9 miR-362靶點預測和熒光素酶活性測定利用Target Scan篩選并確定HDAC6可能為miR-362的潛在調控靶點。擴增野生型或突變型HDAC6 3’UTR并克隆到熒光素酶質粒。將生長匯合至80%的HEK-293T細胞以適當密度接種至6孔板中，隨后用Lipofectamine 2000（美國Invirogen公司）分別將含有HDAC6 3’UTRWT質粒、HDAC6 3’UTRMUT質粒、mimic miR-362和mimic miR-NC共轉染至HEK-293 T細胞。48 h后用雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定熒光素酶活性。

1.10 質粒轉染在BCP+LV-miR-362組、BCP+LV-miR-362+LV-HDAC6組、BCP+LV-HDAC6 siRNA組 和BCP+LV-NC組中，利用Lipofectamine 2000分 別 將 含 有miR-362、miR-362+HDAC6、HDAC6 siRNA的質粒以及空質粒通過鞘內注射的方式轉染入BCP大鼠脊髓。轉染試劑的制備按脂質體（μL）∶DNA（μg）1∶2進行。

1.11 統(tǒng)計學分析正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，所有數據統(tǒng)計分析及作圖采用GraphPad Prism 8.4.0和SPSS 20.0軟件處理。多組間均數比較采用重復測量設計的單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊時組間兩兩比較采用Tamhane’s法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 miR-362過表達抑制大鼠BCP的進展行為學測定結果顯示，與Sham組相比，BCP組的PWT和PWL顯著降低（P＜0.05），而鞘內注射miR-362后，BCP+LV-miR-362組較BCP組各時間點PWT和PWL均顯著升高（P＜0.05），但低于sham組（P＜0.05）；BCP+LV-NC組與BCP組的PWT和PWL差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2）。表明miR-362可部分緩解BCP。

圖2 miR-362過表達抑制大鼠BCP進展Fig.2 Overexpression of miR-362 inhibited bone cancer pain process in rats

2.2 miR-362抑制HDAC6的表達BCP組和BCP+LV-NC組較sham組的miR-362表達顯著下調（P＜0.05），BCP+LV-miR-362轉染組miR-362表達與BCP組相比有明顯恢復（P＜0.05）。HDAC6 mRNA的表達變化則與miR-362相反，相較于sham組，BCP組 和BCP+LV-NC組HDAC6 mRNA表 達顯著上調（P＜0.05），miR-362轉染后與BCP組相比，HDAC6 mRNA的表達顯著抑制（P＜0.05）。此外，HDAC6蛋白的表達變化同HDAC6 mRNA變化類似，BCP組顯著上調，而miR-362則表達抑制（P＜0.05，圖3）。這 表 明，在BCP大 鼠 模 型 中miR-362與HDAC6表達呈負相關，miR-362對HDAC6表達具有抑制作用。

圖3 miR-362抑制HDAC6的 表達Fig.3 miR-362 modulated HDAC6 expression negatively in BCP rats

2.3 HDAC6過表達逆轉miR-362對BCP進展的抑制作用BCP+LV-miR-362組各時間點PWT和PWL較BCP+LV-NC組 顯 著 提 升（P＜0.05），當LV-miR-362+LV-HDAC6共 轉 染 后，BCP+LVmiR-362+LV-HDAC6組各時間點與BCP組相比，PWT和PWL顯著下降（P＜0.05），miR-362的鎮(zhèn)痛效應被逆轉（P＜0.05，圖4）。這表明miR-362可通過抑制HDAC6減輕BCP進展。

圖4 HDAC6過表達逆轉miR-362對大鼠BCP進展的抑制作用Fig.4 Overexpression of HDAC6 reverted the repressive impact of miR-362 in BCP rats

2.4 HDAC6 siRNA對脊髓miR-362、HDAC6和NF-κB p65表達的影響與sham組相比，BCP組中miRNA-362的表達顯著降低（P＜0.05），但BCP組和BCP+LV-HDAC6 siRNA組相比，miRNA-362的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。BCP組中HDAC6和NF-κB p65的表達較sham組顯著升高（P＜0.05），BCP+LV-HDAC6 siRNA組中兩者的表達較BCP組顯著下降（P＜0.05，圖5）。這表明，BCP大鼠中HDAC6和NF-κB p65的表達增高可被HDAC6 siRNA抑制，但不影響miR-362的表達變化。

圖5 下調HDAC6后miR-362、HDAC6和NF-κB p65表達變化Fig.5 Expression changes of miR-362,HDAC6 and NF-κB p65 after HDAC6 downregulation in BCP rats

2.5 HDAC6 siRNA干預后脊髓背角IL-1β、IL-6和TNF-α的水平變化與sham組相比，BCP組大鼠脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α的水平均顯著升高（P＜0.05），BCP+LV-HDAC6 siRNA組中表達均顯著下降（P＜0.05，表2）。這表明，BCP大鼠表達增高的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α在HDAC6沉默后可被廣泛抑制。

表2 下調HDAC6后脊髓IL-1、IL-6和TNF-α的水平變化Tab.2 Expression changes of IL-1,IL-6 and TNF-α after HDAC6 downregulation in BCP rats （ng/g）

2.6 HDAC6為miR-362的靶基因雙熒光素酶實驗結果顯示，與mimic miR-NC+HDAC6 3’UTRWT組相比，mimic miR-362+HDAC6 3’UTRWT組熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05）；與mimic miR-NC+HDAC6 3’UTRMUT組相比，mimic miR-362+HDAC6 3’UTRMUT組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖6）。這表明HDAC6是miR-362的直接作用目標。

圖6 HDAC6為miR-362的靶基因Fig.6 HDAC6 is a target gene of miR-362

3 討 論

BCP是嚴重影響癌癥患者身心健康的臨床難題，給家庭和社會帶來沉重負擔。因此，尋找新型高效的鎮(zhèn)痛方法，提高患者的生活質量有重大意義。miRNA是一種調控型非編碼RNA，它參與轉錄后的調控過程。目前已有研究表明，miRNA與疼痛的調控具有相關性，極有可能成為今后治療BCP的潛在靶點[4]。因此，積極尋找參與BCP發(fā)生發(fā)展的相關miRNA，是BCP的基礎研究和臨床治療的熱點。miR-362位于人染色體Xp11.23，現已被證實與肺癌、卵巢癌、腦膠質瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[9-10,12]。但目前尚無報道其在神經系統(tǒng)中的作用。本研究制作BCP大鼠模型，并探索miR-362的鎮(zhèn)痛作用以及下游鎮(zhèn)痛相關機制。

目前，HDAC6在各種疼痛中的作用受到廣泛關注。SAKLOTH等[13]在小鼠炎性痛和神經病理性痛模型中發(fā)現，HDAC6的特異性阻斷劑ACY-738或ACY-257均能顯著減輕模型小鼠痛行為學反應，由此推斷HDAC6是治療炎性痛和神經病理性痛的潛在靶點。在順鉑誘導的周圍神經病變所引起的疼痛模型中，KRUKOWSKI等[14]發(fā)現，使用HDAC6的特異性阻斷劑ACY-1215，可通過恢復背根神經節(jié)和神經元的線粒體功能，完全逆轉順鉑誘導的周圍神經病變所引起的痛覺過敏。但是，目前以HDAC6為靶點的干預方式均以阻斷劑為主，尚未見其上游miRNA的相關研究報道。本研究發(fā)現，miR-362為HDAC6的上游基因，并且miR-362與HDAC6呈負相關關系。BCP大鼠脊髓miR-362的表達下降伴隨著HDAC6表達的升高；當上調miR-362時，脊髓HDAC6表達顯著下降，并且其痛行為學反應明顯改善。當通過轉染技術轉染HDAC6質粒時，miR-362的鎮(zhèn)痛效應被逆轉，據此推測miR-362在體內是通過抑制HDAC6減輕大鼠BCP的進展。

目前認為，HDAC6是炎性相關疾病發(fā)生發(fā)展的重要調節(jié)因子。ZHANG等[15]研究表明，HDAC6特異性阻斷劑ACY-1215可顯著抑制脂多糖（lipopoly?saccharide,LPS）誘導的RAW264.7巨噬細胞活性氧（reactive oxygen,ROS）的過度分泌，同時也可抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等的表達；其進一步研究發(fā)現，炎癥相關被激活的toll樣受體4（toll like receptor 4,TLR4）、核 因子E2相 關 因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1,HO-1）的蛋白表達以及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和NF-κB p65信號通路被顯著抑制。另外，在一項氧化應激-炎癥的相關研究中發(fā)現，Cay作為一種HDAC6特異性阻斷劑，可通過調節(jié)NF-κB和NOD樣 受 體 家 族3（nucleotide binding oligomeriza?tion domain-like receptors,NLRP3）炎癥小體途徑抑制高血糖誘導的ARPE-19視網膜色素上皮細胞氧化應激、炎癥和凋亡，提示Cay可能是治療糖尿病視網膜病變的一種潛在藥物[16]。本研究發(fā)現，BCP大鼠脊髓HDAC6的表達顯著提高，當用HDAC6 siRNA抑制HDAC6的表達后，miR-362的表達水平無明顯變化，表明HDAC6的下調并不影響miR-362的表達，但BCP大鼠炎癥相關NF-κB p65信號通路出現顯著抑制，其下游IL-1、IL-6和TNF-α表達水平顯著降低。以上均表明，miR-362可能是通過靶向調控HDAC6-NF-κB p65通路完成對BCP大鼠痛覺的調控。

綜上，miR-362在BCP大鼠模型中低表達，上調其表達可通過抑制HDAC6-NF-κB p65信號通路改善痛行為學反應。這為BCP的分子治療提供了新的靶點及理論基礎。