何姣， 葉川， 楊玲， 劉智， 陳茂山， 程雙華， 何正樂(lè)

(1.遂寧市中心醫(yī)院 病理科， 四川 遂寧 629000； 2.成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 & 核工業(yè)四一六醫(yī)院 病理科， 四川 成都 610051)

研究證實(shí)，絕大多數(shù)腫瘤患者體內(nèi)均存在較為明顯的低氧狀態(tài)，腫瘤的低氧會(huì)引發(fā)一系列的病理變化，對(duì)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及免疫逃避等產(chǎn)生重要的影響[1-3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α) 是細(xì)胞在低氧條件下產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，扮演著重要的角色，能增強(qiáng)腫瘤侵襲性，是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一[4-6]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter,Glut)基因是HIF的下游基因之一，Glut-1為細(xì)胞提供基本的葡萄糖供應(yīng)，并為增殖分裂細(xì)胞提供相應(yīng)增加的葡萄糖，對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和増殖具有重要的意義[7]。本研究通過(guò)檢測(cè)皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cutaneous squamous cell carcinom，SCC)和癌旁皮膚組織中的HIF-1α和Glut-1表達(dá)，探討HIF-1α和Glut-1在皮膚SCC中的表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1一般材料 選擇2014年3月—2019年12月住院的SCC手術(shù)病人63例，術(shù)前均未接受抗腫瘤治療；男45例、女18例，年齡33～79歲、平均(55.32±13.74)歲，病程3～37個(gè)月，平均(18.05±8.71)月；按WHO分類標(biāo)準(zhǔn)將SCC分化程度分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，Ⅰ級(jí)為高分化、34例，Ⅱ級(jí)為中分化、20例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)為低分化、9例；23例病理證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有20例進(jìn)行電話隨訪。63例患者手術(shù)切除SCC組織作為觀察組、其癌旁組織作為對(duì)照組。

1.1.2主要試劑 兔抗人HIF-1α單克隆抗體、兔抗人Glut-1多克隆抗體均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，EnVision檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Dako公司。

1.2 方法

1.2.1HIF-1α和Glut-1表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測(cè)2組組織中HIF-1α和Glut-1表達(dá)水平，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，所有切片染色均采用相同條件，每批染色均設(shè)陽(yáng)性、空白對(duì)照，空白對(duì)照以PBS代替一抗孵育組織切片。

1.2.2結(jié)果判定 由2名工作經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師在雙盲條件下獨(dú)立閱片，以胞核或胞漿被染成淺黃色、棕黃色或黃褐色判定為HIF-1α陽(yáng)性結(jié)果，胞膜及胞漿被染成淺黃色、棕黃色或黃褐色判定為Glut-1陽(yáng)性結(jié)果。如對(duì)同一份組織具有不同的意見(jiàn)，則討論決定最終結(jié)果。在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，參考文獻(xiàn)[5]以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，10%～50%為中度陽(yáng)性(++)，<10%為弱陽(yáng)性(+)，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性(-)。

1.3 觀察指標(biāo)

比較2組組織中HIF-1α和Glut-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況，分析HIF-1α、Glut-1在皮膚SCC中表達(dá)的相互關(guān)系，分析HIF-1α、Glut-1的表達(dá)與SCC患者臨床病理特征(性別、年齡、SCC分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)及預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α和Glut-1表達(dá)

HIF-1α主要表現(xiàn)為程度不等的胞漿及胞核染色，Glut-1主要表現(xiàn)為程度不等的胞漿及胞膜染色(圖1)。HIF-1α在SCC組和對(duì)照組組織中的陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)分別為49例和7例，陽(yáng)性百分率為77.8%和11.1%，SCC組(+)、(++)及(+++)患者數(shù)量分別為25例、13例、11例；Glut-1在SCC組和對(duì)照組組織中的陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)分別為45例和6例，陽(yáng)性百分率為71.4%和9.5%，SCC組(+)、(++)患者數(shù)量分別為34例、11例；觀察組HIF-1α和Glut-1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=57.152、50.177，P<0.001)。詳見(jiàn)表1。

HIF-1α Glut-1

表1 SCC組和對(duì)照組HIF-1α、Glut-1表達(dá)[n(%)]

2.2 HIF-1α與Glut-1表達(dá)的相互關(guān)系

HIF-1α與Glut-1在皮膚SCC中的表達(dá)明顯相關(guān)(r=0.507，P<0.001)。GLUT-1在HIF-1α陽(yáng)性組中的表達(dá)(陽(yáng)性率83.7%)明顯高于在HIF-1α陰性組中的表達(dá)(陽(yáng)性率28.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.943，P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 HIF-1α、Glut-1在SCC表達(dá)的相關(guān)性

2.3 HIF-1α和Glut-1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

45例男性患者中，HIF-1α表達(dá)33例(73.3%)，Glut-1表達(dá)30例(66.7%)；18例女性患者中，HIF-1α表達(dá)16例(88.9%)，Glut-1表達(dá)15例(83.3%)；HIF-1α、Glut-1的表達(dá)在男女患者間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.771，P=0.183；χ2=1.750，P=0.186)。HIF-1α、Glut-1的表達(dá)在>60歲以上或者≤60歲患者的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.766，P=0.184；χ2=2.219，P=0.136)。HIF-1α、Glut-1的表達(dá)和SCC分化程度有關(guān)，在高、中、低分化組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.669，P<0.001；P=7.587，P=0.023)。見(jiàn)表3。

表3 HIF-1α、Glut-1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 HIF-1α及Glut-1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

為了進(jìn)一步探討HIF-1α、Glut-1的陽(yáng)性表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，將HIF-1α、Glut-1表達(dá)與患者的術(shù)后總生存時(shí)間繪制了Kaplan-Meier曲線，并使用log-rank對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)與患者的不良預(yù)后無(wú)明顯的相關(guān)性(r=0.132，P=0.361)，Glut-1的陽(yáng)性表達(dá)與患者的不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.358，P=0.042)，如圖2所示。

圖2 HIF-1α、Glut-1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

HIF是一種能特異性地結(jié)合于促紅細(xì)胞生成素(EPO)的蛋白，近年來(lái)，HIF與腫瘤的關(guān)系逐漸被廣大學(xué)者所重視[8-10]。相關(guān)研究指出，HIF是細(xì)胞進(jìn)行缺氧適應(yīng)的關(guān)鍵因子，包括三種亞型(HIF-1、HIF-2、HIF-3)[11]。近年來(lái)臨床研究中以HIF-1、HIF-2較多[12-14]。HIF-1分子量為120 KDa，α亞單位位于14號(hào)染色體上，其作為一種異源二聚體，是HIF-1的主要活性調(diào)節(jié)亞基團(tuán)。本研究中，HIF-1α主要表現(xiàn)為程度不等的胞漿及胞核染色，在SCC和正常組織中，陽(yáng)性表達(dá)率為77.8%和11.1%，與國(guó)內(nèi)外研究相符[15-16]。SCC中HIF-1α陽(yáng)性(+)、陽(yáng)性(++)、陽(yáng)性(+++)的表達(dá)情況明顯高于對(duì)照組(χ2=57.152，P<0.001)，與張紅等[17]、An等[18]和郝玉琴等[19]研究結(jié)果一致，說(shuō)明HIF-1α能夠在一種缺氧、缺血的環(huán)境中，仍可得到足夠的能量，并為細(xì)胞的增殖、擴(kuò)散形成了有利的的條件。HIF-1α的表達(dá)和SCC分化程度密切相關(guān)，分化程度越高，陽(yáng)性表達(dá)率也越高。

Glut-1位于HIF-1α的下游，是HIF-1的鞭基因之一，可為細(xì)胞的增殖、分裂給予基本的葡萄糖供應(yīng)，對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和増殖具有重要的意義。在以往乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞內(nèi)均發(fā)現(xiàn)Glut-1的高表達(dá)，Glut-l 的活性和表達(dá)水平與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。本研究中，Glut-1主要表現(xiàn)為程度不等的胞漿及胞膜染色，在SCC和正常組織中，陽(yáng)性表達(dá)率分別為71.4%和9.5%，與其他研究相符[6-7,15-16]。SCC中Glut-1陽(yáng)性(+)、陽(yáng)性(++)的表達(dá)情況明顯高于對(duì)照組(χ2=50.177，P<0. 001)。

同時(shí)本研究相關(guān)性分析還證實(shí)了HIF-1α、Glut-1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.507，P<0.001)，GLUT-1 在HIF-1α陽(yáng)性組中的表達(dá)(陽(yáng)性率83.7%)明顯高于在HIF-1α陰性組中的表達(dá)(陽(yáng)性率28.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.943，P<0.001)，Glut-1作為HIF-1α下游靶基因，其表達(dá)水平受HIF-1α調(diào)控，在基因沉默低氧條件下，近端腎小管上皮細(xì)胞中HIF-1α水平抑制Glut-1表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及壞死。廖志東等[20]、張欣等[21]通過(guò)研究得出結(jié)論，Glut-1及VEGF與乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且其表達(dá)表達(dá)水平與疾病進(jìn)展呈正相關(guān)。可見(jiàn)無(wú)論是靶向上調(diào)亦或是靶向下調(diào)HIF-1α水平，均可有效調(diào)控Glut-1的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝及血管生成的過(guò)程，并對(duì)這些過(guò)程產(chǎn)生影響。

本研究嘗試性探討HIF-1α、Glut-1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)與患者的不良預(yù)后無(wú)明顯的相關(guān)性(P=0.361)，Glut-1的陽(yáng)性表達(dá)與患者的不良預(yù)后有一定的相關(guān)性(P=0.042)，但還不能有效說(shuō)明HIF-1α、Glut-1表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響，需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，皮膚SCC組織中HIF-1α和Glut-1呈高表達(dá)，且與分化程度相關(guān)，隨著分化程度增加，HIF-1α和Glut-1陽(yáng)性表達(dá)升高。深入探究HIF-1α和Glut-1的作用機(jī)制有望為皮膚SCC精準(zhǔn)治療和預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。