吳琦， 王洪偉， 鄭慧哲， 于建渤， 王紅艷， 于微， 于澤宇， 郭素芬**

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 病理診斷中心， 黑龍江 牡丹江 157000； 2.牡丹江市第二人民醫(yī)院, 黑龍江 牡丹江 157000； 3.牡丹江市康安醫(yī)院, 黑龍江 牡丹江 157000； 4.牡丹江醫(yī)學(xué)院, 黑龍江 牡丹江 157000)

胃癌(gastric cancer, GC)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]，由于缺乏明顯的癥狀和篩查方案，大多數(shù)患者在首次診斷時(shí)就發(fā)現(xiàn)為晚期GC[2]，且通常預(yù)后不良[3]。GC的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致GC患者死亡及預(yù)后不良的主要因素[4]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)被報(bào)道參與調(diào)控多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[5-6]，另有研究報(bào)道toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)/骨髓分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)/核轉(zhuǎn)錄因κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)信號(hào)通路在介導(dǎo)炎癥及腫瘤的惡性行為中發(fā)揮著重要作用[7-8]。HMGB1能否通過TLR4/MyD88/NF-κB通路對(duì)GC的惡性行為產(chǎn)生影響，目前尚未見相關(guān)報(bào)道，故本研究通過基因干擾技術(shù)干擾HMGB1在GC細(xì)胞中的表達(dá)，并檢測(cè)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子的變化及GC細(xì)胞生物學(xué)行為變化，以闡明HMGB1對(duì)GC細(xì)胞惡性行為影響的內(nèi)在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 人胃癌細(xì)胞株MGC-803、SGC-7901、人胃上皮細(xì)胞株GES-1；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，胰酶、絲裂霉素C(Sigma，美國(guó))，Transwell小室(Corning，美國(guó))，Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR Mastermix(BioTeke，北京)，SYBR Green(Solarbio，北京)，全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、ECL發(fā)光液、HMGB一抗、TLR4一抗、NF-κB p65一抗、MyD88一抗、p-NF-κB p65一抗、羊抗兔IgG-HRP(wanleibio，中國(guó))，PVDF膜(Millipore，美國(guó))。

1.1.2主要儀器 電泳儀(DYY-7C，北京六一)，凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B型，北京六一)，超速冷凍離心機(jī)(H-2050R，湖南湘儀)，酶標(biāo)儀(ELX-800，Biotek)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH36001B，天津泰斯特)，紫外分光光度計(jì)(NANO 2000，Thermo)，熒光定量PCR儀(Exicycler 96，Exicycler 96)，倒置相差顯微鏡(IX53，OLYMPUS)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%左右，將細(xì)胞隨機(jī)均分為3組，分別為Control組(未轉(zhuǎn)染組)、HMGB1 siRNA-NC組(HMGB1 siRNA陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組)及HMGB1 siRNA組(HMGB1 siRNA轉(zhuǎn)染組)；于轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量定量(Real-time)PCR、侵襲及遷移檢測(cè)，于48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot試驗(yàn)。

1.2.2劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將細(xì)胞接種于6孔板中，在劃痕前將培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基并加入1 mg/L的絲裂霉素C處理1 h；將細(xì)胞造成細(xì)胞劃痕，以無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞1次，除去細(xì)胞碎片，顯微鏡下觀察拍照，記下照片中細(xì)胞的位置，為后續(xù)拍照準(zhǔn)備，并換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。將各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h拍照記錄。最后計(jì)算細(xì)胞的遷移距離。

1.2.3Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 采用Matrigel膠原包被到小室膜上建立Transwell侵襲小室模型。將細(xì)胞培養(yǎng)至90%融合，以0.2%胰蛋白酶消化、并以無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，以PBS進(jìn)行10倍稀釋(滴入一滴臺(tái)盼藍(lán)染料)、混勻、室溫靜置2 min，在下室加入含10% FBS的培養(yǎng)液800 μL、分別取細(xì)胞懸液200 μL(細(xì)胞數(shù)為2×104/孔)加入上室，將24孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，之后進(jìn)行固定和結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下對(duì)遷移至微孔膜下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA水平 收集需要檢測(cè)總RNA的細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA的濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以cDNA為模板，采用目的基因的引物，按照cDNA模板1 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、SYBR Green mastermix 10 μL用ddH2O補(bǔ)足至20 μL，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)檢測(cè)目的基因的mRNA水平，條件為94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃ 延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；按72 ℃ 2.5 min，40 ℃ 1.5 min，并從60 ℃加熱到94 ℃(1.0 ℃/1 s)，25 ℃ 1～2 min的條件檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，最后利用2-△△CT方法進(jìn)行結(jié)果分析。HMGB1上游引物序列為GATGTTGCGAAGAAACTGGG、下游引物序列為TTCAGCCTTGACAACTCCCT，TLR4 上游引物序列為GACCTGTCCCTGAACCCTA、下游引物序列為TCTCCCAGAACCAAACGA，Myd88上游引物序列為TACAAGGCAATGAAGAAAGAGT、下游引物序列為CAAGGCGAGTCCAGAACC，NF-κB p65上游引物序列為GGGGACTACGACCTGAATG、下游引物序列為GGGCACGATTGTCAAAGAT，β-actin 上游引物序列為CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG、下游引物序列為CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT。

1.2.5Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后按照40 μg/孔的蛋白量上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印、封閉，4 ℃過夜孵育一抗，37 ℃ 45 min孵育二抗；行ECL底物發(fā)光后，將膠片進(jìn)行掃描，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1A與1B，與GES-1相比較，GC細(xì)胞MGC-803與SGC-7901在培養(yǎng)24 h后細(xì)胞遷移能力均明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。采用MGC-803進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，如圖1C與1D所示，與Control組相比，HMGB1 siRNA組的遷移能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明，在GC細(xì)胞中干擾HMGB1基因的表達(dá)能夠降低細(xì)胞的遷移能力。

注：(1)與GES-1組相比，P<0.01；(2)與Control組比較，P<0.01。

2.2 細(xì)胞侵襲能力

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，與GES-1比較，兩株GC細(xì)胞系的侵襲力均增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。除此之外，從圖2A與2B的結(jié)果中可見，MGC-803較SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力更強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。選擇MGC-803細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與Control組比較，HMGB1 siRNA組遷移率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2C與2D。

注：(1)與GES-1組相比，P<0.01；(2)與MGC-803組相比，P<0.01；(3)與Control組比較，P<0.01。

2.3 各基因mRNA表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果如圖3A所示，SGC-7901及MGC-803細(xì)胞的HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA水平均明顯高于GES-1細(xì)胞，同時(shí)在MGC-803細(xì)胞的mRNA水平也較SGC-7901細(xì)胞明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。選取HMGB1相對(duì)高表達(dá)的MGC-803細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，如圖3B所示，與Control組相比，HMGB1 siRNA組TLR4、MyD88 mRNA水平均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但檢測(cè)結(jié)果顯示，NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

注：與GES-1組比較，(1)P<0.01；(2)與MGC-803組比較，P<0.01；(3)與Control組比較，P<0.01。

2.4 各蛋白表達(dá)水平

2.4.1GES-1細(xì)胞、SGC-7901及MGC-803細(xì)胞 Western blot結(jié)果顯示，與GES-1細(xì)胞比較，SGC-7901及MGC-803細(xì)胞中HMGB1、TLR4、MyD88及p-NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，NF-κB p65表達(dá)不變。同時(shí)各指標(biāo)在MGC-803細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平較SGC-7901細(xì)胞也明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

注：(1)與GES-1組比較，P< 0.01；(2)與MGC-803組比較，P< 0.01。

2.4.2HMGB1對(duì)MGC-803中蛋白表達(dá)量的影響 利用HMGB1干擾片段轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞后，如圖5所示，與Control組比較，除總NF-κB p65表達(dá)不變外，各指標(biāo)的蛋白表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示干擾HMGB1的表達(dá)可能能夠抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的活化，且HMGB1的表達(dá)及TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的活化與細(xì)胞的惡性表型密切相關(guān)。

注：(1)與NC組比較，P< 0.01。

3 討論

GC是世界上最常見的惡性程度最高的胃腸道腫瘤[9-10]。GC死亡率高的主要原因是GC的惡性程度太高[11-13]。侵襲和遷移是GC惡性進(jìn)展的主要生物學(xué)特征，與GC的治療和預(yù)后密切相關(guān)[14-15]。因此，尋找影響腫瘤遷移和侵襲的相關(guān)基因，明確能準(zhǔn)確區(qū)分GC轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物與靶標(biāo)分子是目前研究的重中之重。

HMGB1是高遷移率族盒超家族中的一種蛋白，具有廣泛的表達(dá)[16]。HMGB1在炎癥和腫瘤細(xì)胞遷移等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用[17-19]。細(xì)胞外HMGB1可通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放和募集白細(xì)胞來觸發(fā)和維持炎癥反應(yīng)[20]。因此，它已被用作許多疾病的關(guān)鍵分子靶標(biāo)[21]。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)它參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，HMGB1通過調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄在癌癥的發(fā)展中起作用[22]。HMGB1也被證實(shí)在許多人類癌癥中過度表達(dá)[6，23-24]。研究結(jié)果一致表明，阻斷HMGB1的表達(dá)抑制了癌癥的進(jìn)展。本研究的結(jié)果也顯示，HMGB1在GC細(xì)胞中高表達(dá)，在干擾HMGB1的表達(dá)后，GC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力被抑制，表明干擾HMGB1確實(shí)能夠阻斷GC的進(jìn)展。此外，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活被報(bào)道參與腫瘤的惡性進(jìn)展。其中TLR4是生物體內(nèi)典型的模式識(shí)別受體，TLR4在接受腫瘤的抗原信息時(shí)，激活MyD88，并進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB的核易位，最終激活基因轉(zhuǎn)錄[25]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，MyD88的高表達(dá)水平與上皮性卵巢癌患者的總體生存率低相關(guān)。因此，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)可能是一個(gè)有效的抑制癌癥進(jìn)展的方法。HMGBl是TLR4的一種內(nèi)源性配體，TLR4作為一種跨膜受體，能夠激活MyD88依賴的信號(hào)，以響應(yīng)HMGB1的結(jié)合。HMGB1介導(dǎo)的TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)與許多不同類型癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[26]。然而，其在GC中的作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，當(dāng)在GC細(xì)胞中干擾HMGB1的表達(dá)后，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)被抑制，在表型實(shí)驗(yàn)中也觀察到相應(yīng)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力受到顯著的抑制。

綜上所述，在GC的進(jìn)程中，HMGB1發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用，其可能的分子機(jī)制是通過激活TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)GC侵襲轉(zhuǎn)移。這一研究結(jié)果可為臨床上研究治療GC的靶向藥物提供科學(xué)的參考。