李慧，劉晶

1西北婦女兒童醫(yī)院兒童血液腫瘤科，西安 710003

2寶雞市婦幼保健院兒童醫(yī)院兒童感染科，陜西 寶雞 721000

惡性淋巴瘤是起源于淋巴造血組織的一種實(shí)體腫瘤，以無(wú)痛性的淋巴結(jié)腫大為主要表現(xiàn)，可伴有發(fā)熱、消瘦等癥狀。惡性淋巴瘤可發(fā)生于任何年齡段，但近年來(lái)，小兒惡性腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤組織中存在多種異常增殖因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、可溶性B7家族成員 H4（soluble B7 family member H4，sB7-H4）等。但目前國(guó)內(nèi)有關(guān)VEGF、NSE及sB7-H4與小兒惡性淋巴瘤相關(guān)性的研究報(bào)道較為少見。因此，本研究檢測(cè)VEGF、NSE及sB7-H4在小兒惡性淋巴瘤中的表達(dá)情況，分析其對(duì)小兒惡性淋巴瘤的診斷價(jià)值，旨在為小兒惡性淋巴瘤的診治提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月至2020年12月西北婦女兒童醫(yī)院收治的惡性淋巴瘤患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合惡性淋巴瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②未經(jīng)正規(guī)治療，且近3個(gè)月內(nèi)無(wú)藥物服用史；③臨床和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急性心梗死、腦出血等急性危重疾??；②合并凝血功能障礙；③合并重度脂肪肝、肝腎功能重度不全。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入54例惡性淋巴瘤患兒，其中男31例，女23例；年齡1～13歲，平均（6.48±1.13）歲；病理類型：霍奇金淋巴瘤19例，非霍奇金淋巴瘤35例；臨床分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期11例，Ⅲ期21例，Ⅳ期15例。取54例惡性淋巴瘤患兒的淋巴瘤組織和距腫瘤組織3 cm處的正常組織。

1.2 免疫組化法檢測(cè)VEGF、NSE及sB 7-H 4蛋白的表達(dá)情況

取54例惡性淋巴瘤患兒的淋巴瘤組織和距腫瘤組織3 cm處的正常組織，立即用10%甲醛固定，65℃烤片20 min后常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，置于pH=6.0的緩沖液中煮沸（95℃，15～20 min），自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，每次5 min，進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min（用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，一抗稀釋比例均為1∶100）。滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）/過氧化氫反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

1.3 結(jié)果判定

VEGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)，NSE主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，sB7-H4主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分；染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色染色為1分，棕黃色染色為2分，棕褐色染色為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，總分≥3分為陽(yáng)性，＜3分為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 VEGF、NSE及sB 7-H 4表達(dá)情況的比較

惡性淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB7-H4陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中VEGF、NSE及sB 7-H 4陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB 7-H 4表達(dá)情況的比較

不同年齡、性別、病理類型和惡性程度惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB7-H4陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB7-H4陽(yáng)性表達(dá)率均高于Ⅰ～Ⅱ期患兒，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ=7.422、6.400、7.269，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF、NSE及sB 7-H 4表達(dá)情況（n=54）

2.3 VEGF、NSE、sB 7-H 4單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)小兒惡性淋巴瘤的診斷價(jià)值

ROC曲線結(jié)果示，VEGF、NSE、sB7-H4單獨(dú)檢測(cè)診斷小兒惡性淋巴瘤的AUC分別為0.632、0.731、0.674，VEGF+NSE+sB7-H4聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.805，明顯高于單獨(dú)檢測(cè)。（表3、圖1）

圖1 VEGF、NSE、sB 7-H 4單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)小兒惡性淋巴瘤的ROC曲線

表3 VEGF、NSE、sB 7-H 4單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)小兒惡性淋巴瘤的診斷價(jià)值

3 討論

目前有關(guān)惡性淋巴瘤發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與環(huán)境、感染等有關(guān)。近年來(lái)，惡性淋巴瘤的發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)，對(duì)患者身心健康可造成一定影響，早期診斷治療對(duì)改善惡性淋巴瘤患者的預(yù)后有重要意義。因此，本研究探討VEGF、NSE及sB7-H4在小兒惡性淋巴瘤中的表達(dá)情況，旨在為惡性淋巴瘤的早期診斷治療提供參考。

VEGF又稱為血管通透因子，具有增加促進(jìn)血管通透性、促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤新生血管生成等作用。本研究結(jié)果顯示，42.59%的惡性淋巴瘤組織中VEGF表達(dá)陽(yáng)性，高于正常組織；且臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期患兒，表明VEGF的表達(dá)可能與惡性淋巴瘤的進(jìn)展有關(guān)。但Navone等的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)與惡性淋巴瘤病理類型、年齡有關(guān)，與本研究報(bào)道不符，這可能與納入病例數(shù)不同、地域差異等有關(guān)。

NSE是一種普遍存在于哺乳動(dòng)物中的糖酵解酶。目前，NSE主要作為神經(jīng)系統(tǒng)損傷與小細(xì)胞肺癌的標(biāo)志物。但隨著研究的不斷深入，已有多項(xiàng)研究報(bào)道了NSE與惡性淋巴瘤的關(guān)系。Oya等研究發(fā)現(xiàn)，NSE在小兒惡性淋巴瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率高于健康對(duì)照組。與本研究結(jié)果相符，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中NSE陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期患兒。表明NSE在惡性淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，可作為病情監(jiān)測(cè)、療效評(píng)估的有效指標(biāo)。

B7-H4是一種新型的協(xié)同刺激分子。Podojil等研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4以可溶性的形式分布于腫瘤患兒血清中。人B7-H4基因的mRNA大量分布于淋巴組織與非淋巴組織中，但其蛋白則不表達(dá)于大部分正常組織中。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4在肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，且其表達(dá)上調(diào)與患兒的臨床分期密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，淋巴瘤組織中sB7-H4的陽(yáng)性表達(dá)率更高，且臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期的惡性淋巴瘤患兒淋巴瘤組織中sB7-H4陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期患兒。表明sB7-H4有望成為新的惡性淋巴瘤監(jiān)測(cè)的腫瘤標(biāo)志物。

Katagiri等研究指出，部分因子可作為惡性淋巴瘤診斷、病情評(píng)估、疾病進(jìn)展的敏感生物標(biāo)志物。但國(guó)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，單一因子檢測(cè)易造成誤診或漏診，多主張多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)。本研究通過ROC曲線分析結(jié)果顯示，VEGF、NSE及sB7-H4單獨(dú)檢測(cè)均可有效診斷惡性淋巴瘤，但聯(lián)合檢測(cè)診斷小兒惡性淋巴瘤的AUC最大，與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。但本研究納入的樣本量較小，有可能存在一定偏差，尚需要更大樣本量、多中心的研究證實(shí)。

綜上所述，VEGF、NSE及sB7-H4在惡性淋巴瘤中呈異常表達(dá)，三者聯(lián)合檢測(cè)并結(jié)合臨床特征有助于提高惡性淋巴瘤的診斷效能。