李艷，陳文玉，陳小平，陳友國

1鹽城市第一人民醫(yī)院/南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 鹽城 224001

2蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 蘇州 215006

宮頸癌是臨床最常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居女性所有惡性腫瘤的第二位，病死率居首位。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全球每年新增宮頸癌約60萬例，新增病死30萬例，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。值得注意的是，中國每年新增宮頸癌患者超過全球新增宮頸癌病例的1/5，且呈年輕化趨勢(shì)，發(fā)病率和病死率遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國家，嚴(yán)重影響中國女性的生命健康。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，但目前臨床關(guān)于宮頸癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。早期宮頸癌多無明顯癥狀，極大地影響了宮頸癌患者的早期臨床診斷和治療，因此，積極探索宮頸癌早期診斷和治療的生物標(biāo)志物對(duì)臨床宮頸癌的診斷和治療有重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種內(nèi)源性小分子非編碼RNA。近年來，越來越多的研究表明，miRNA能夠調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，對(duì)多種腫瘤增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有調(diào)控作用。miRNA-451是miRNA家族的重要成員之一，能夠通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）等多種信號(hào)通路，抑制肝癌、胃癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，被認(rèn)為是一種重要的抑癌因子。研究表明，miRNA-451在肝癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中異常表達(dá)，而miRNA-451過表達(dá)能夠明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，被認(rèn)為是肝癌預(yù)防和治療的潛在生物靶點(diǎn)。但miRNA-451表達(dá)情況與宮頸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究較少，因此，本研究探討miRNA-451在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床特征的相關(guān)性，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討miRNA-451-mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖與凋亡的影響及可能機(jī)制，旨在為今后宮頸癌的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月至2018年12月鹽城市第一人民醫(yī)院收治的60例宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為初次確診；均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸癌；術(shù)前未進(jìn)行放療、化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前進(jìn)行化療、放療或激素治療；肝腎功能不全或合并其他惡性腫瘤。60例宮頸癌患者年齡20～65歲；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌37例，腺癌23例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；分化程度：低分化19例，中高分化41例；基層浸潤深度：≥1/2 35例，＜1/2 25例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。取60例宮頸癌患者的宮頸癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織，迅速置于液氮中冷凍，-80℃保存待檢。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人宮頸癌Hela細(xì)胞株購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所?？俁NA提取試劑盒、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒、無酶水均購自天根生化科技（北京）有限公司，miRNA-451模擬物（miRNA-451-mimics）、miRNA-451-mimics陰性對(duì)照（miRNA-451-mimics-NC）均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，miRNA-451上游引物、下游引物和探針均由上海星漢生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，胎牛血清、青霉素-鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所，Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Scientific公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購自江蘇凱基生物技術(shù)公司，磷酸化AKT（phosphoinositide AKT，p-AKT）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、β-actin一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗均購自美國CST公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀均購自美國Bio-Rad公司，CO培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司，流式細(xì)胞儀購自美國艾森公司，離心機(jī)購自上海舜制儀器公司，轉(zhuǎn)印電泳儀購自北京六一公司，轉(zhuǎn)膜儀購自美國Hoefer公司。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)宮頸癌組織和癌旁正常組織中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量 采用RNA提取試劑盒提取宮頸癌組織和癌旁正常組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），采用qRT-PCR法檢測(cè)miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1μl，上下游引物 1 μl，PCR 熒光定量染料 5 μl，無酶水 4 μl。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，采用 2法計(jì)算miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量。GAPDH上游引物：5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3'，下游引物：5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'；miRNA-451上游引物：5'-AAAGTCGACAAGCTCTCTGCTCAGCCTGTC-3'，下游引物：5'-AAAATATCTCGAGCCCCCACCCCTGCCTTGT-3'。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 宮頸癌Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將Hela細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、miRNA-451-mimics組和miRNA-451-mimics-NC組，分別取20μg的miRNA-451-mimics和miRNA-451-mimics-NC加入至10 ml培養(yǎng)基中，并分別加入20μl的Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑輕輕混合均勻，室溫下孵育20 min后取適量加入至各組細(xì)胞中，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 取對(duì)照組和 miRNA-451-mimics組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 6、12、24、36、48 h，qRT-PCR法檢測(cè)miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量。取對(duì)照組、miRNA-451-mimics組及miRNA-451-mimics-NC組細(xì)胞，以5000/孔接種至96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別轉(zhuǎn)染6、12、24、36、48 h后，每孔加入10μl的CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝（A-A）（/A-A）×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期情況 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)miRNA-451-mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響。取轉(zhuǎn)染24 h后的對(duì)照組、miRNA-451-mimics組及miRNA-451-mimics-NC組細(xì)胞，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3遍后收集細(xì)胞，用75%乙醇固定12 h，離心去除乙醇后加入PBS重懸細(xì)胞然后加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑500 μl，避光孵育15 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)miRNA-451-mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響。取轉(zhuǎn)染24 h后的對(duì)照組、miRNA-451-mimics組及miRNA-451-mimics-NC組細(xì)胞，棄去上清液，PBS清洗3次后收集細(xì)胞，加入500μl結(jié)合液重懸細(xì)胞后分別加入膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/PI試劑各 5 μl，避光孵育15 min后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)p-AKT、Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量 取轉(zhuǎn)染24 h后對(duì)照組、miRNA-451-mimics組及miRNA-451-mimics-NC組宮頸癌Hela細(xì)胞，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度制備蛋白樣品。取30μg蛋白樣品經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后，運(yùn)用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至固相載體聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。運(yùn)用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入p-AKT、Bcl-2、β-actin一抗（稀釋濃度均為1∶1000）孵育過夜，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋濃度為1∶10 000）室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法檢測(cè)并用Image J 2.0圖像軟件進(jìn)行灰度值分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算p-AKT、Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織和癌旁正常組織中miRNA-451相對(duì)表達(dá)量的比較

癌旁正常組織中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量為（6.808±2.402），明顯高于宮頸癌組織中的（1.165±0.415），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.78，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451表達(dá)情況的比較

以宮頸癌組織中miRNA-451相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為界值，miRNA-451低表達(dá)30例，miRNA-451高表達(dá)30例。不同年齡、病理類型、肌層浸潤深度宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同F(xiàn)IGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451相對(duì)表達(dá)量的比較（n=60）

2.3 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間宮頸癌Hela細(xì)胞中miRNA-451相對(duì)表達(dá)量和增殖能力的比較

隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，miRNA-451-mimics組宮頸癌Hela細(xì)胞中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），且轉(zhuǎn)染24 h時(shí)，miRNA-451-mimics的轉(zhuǎn)染效率最高，因此選擇轉(zhuǎn)染24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染條件。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，miRNA-451-mimics組宮頸癌Hela細(xì)胞的存活率逐漸降低。（表2、表3）

表2 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間宮頸癌Hela細(xì)胞中miRNA-451相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表3 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間宮頸癌Hela細(xì)胞的存活率（%，±s）

2.4 miRNA-451過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染24 h后，miRNA-451-mimics組細(xì)胞G/G期細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組和miRNA-451-mimics-NC組，G/M期細(xì)胞百分比明顯低于對(duì)照組和miRNA-451-mimics-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但3組S期細(xì)胞百分比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖1、表4）

表4 miRNA-451過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響（%，±s）

圖1 miRNA-451過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響

2.5 miRNA-451過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染24 h后，miRNA-451-mimics組細(xì)胞的凋亡率為（33.727±2.096）%，明顯高于對(duì)照組的（0.883±0.246）%和 miRNA-451-mimics-NC組的（1.660±0.649）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.12、20.77，P＜0.1）。（圖2）

圖2 miRNA-451過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響

2.6 miRNA-451過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞p-AKT、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

miRNA-451-mimics組宮頸癌Hela細(xì)胞p-AKT、Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表5）

表5 對(duì)照組與miRNA-451過表達(dá)組宮頸癌Hela細(xì)胞p-AKT、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

3 討論

宮頸癌是臨床常見的女性惡性腫瘤，2018年全球?qū)m頸癌調(diào)查研究報(bào)告顯示，中國宮頸癌發(fā)病率明顯高于歐美等發(fā)達(dá)國家，且呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性生命健康。此外，宮頸癌患者的預(yù)后較差，5年生存率低于50%，且其發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，與細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、基因異常表達(dá)、凋亡等多種過程密切相關(guān)。早期診斷、早期治療，對(duì)降低宮頸癌患者的病死率、提高生存質(zhì)量、改善預(yù)后均有重要意義。但由于宮頸癌早期缺乏特異性的癥狀，容易造成漏診和誤診。因此，積極尋找宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物標(biāo)志物對(duì)臨床宮頸癌的早期診斷和靶向治療有重要意義。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的單鏈非編碼RNA，對(duì)多種基因表達(dá)具有調(diào)控作用，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。越來越多的研究表明，miRNA調(diào)控基因的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。值得注意的是，miRNA在血清和組織中的穩(wěn)定性高，具有作為宮頸癌臨床診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛能。研究表明，miRNA-145、miRNA-34a、miRNA-206、miRNA-21等多種miRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。Anusha等研究表明，miRNA-145能夠通過靶向SMAD 作用蛋白 1（SMAD-interacting protein 1，SIP1）調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miRNA-206是一種抑癌基因，能夠明顯抑制肝癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生。Chen等的研究表明，miRNA-206與宮頸癌發(fā)生發(fā)展及患者的預(yù)后相關(guān)，被認(rèn)為是一個(gè)潛在的宮頸癌診斷及治療靶標(biāo)。

miRNA-451位于人第17號(hào)染色體，是一種與細(xì)胞代謝密切相關(guān)的miRNA，具有抑制多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，被認(rèn)為是一種潛在的抗腫瘤治療的生物標(biāo)志物。研究表明，miRNA-451能夠靶向調(diào)控PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號(hào)通路，從而抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，在腫瘤診斷、病情監(jiān)測(cè)及靶向治療方面有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-451的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，且與宮頸癌患者的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及分化程度可能有關(guān)，表明miRNA-451可能有抑制宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用。因此，進(jìn)一步進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討miRNA-451過表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖與凋亡的影響及可能的機(jī)制，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后，miRNA-451-mimics組宮頸癌Hela細(xì)胞的存活率明顯降低，miRNA-451過表達(dá)能夠?qū)m頸癌Hela細(xì)胞的周期阻滯于G/G期并明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。AKT是一種重要的調(diào)節(jié)分子，與細(xì)胞增殖分化、能量代謝及惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種過程密切相關(guān)。Zhang等的研究結(jié)果表明，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，AKT的表達(dá)水平明顯升高，與宮頸癌發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后明顯相關(guān)。Bcl-2是AKT下游重要的抗凋亡蛋白，與多種腫瘤發(fā)生及惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，miRNA-451-mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染能夠明顯降低宮頸癌Hela細(xì)胞中p-AKT、Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量，表明miRNA-451能夠通過抑制p-AKT、Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。由此可見，miRNA-451在宮頸癌組織中低表達(dá)，且與宮頸癌患者FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度相關(guān)，其過表達(dá)能通過阻斷AKT/Bcl-2信號(hào)通路來抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，miRNA-451能夠通過阻斷AKT/Bcl-2信號(hào)通路，抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，有可能成為宮頸癌臨床診斷、病情監(jiān)測(cè)及靶向治療的生物標(biāo)志物。