何永恒，馮國(guó)軍，劉大軍，劉 暢，楊曉旭，閆志山

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080；2黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150080）

0 引言

菜豆(Phaseolus vulgaris)又名四季豆、蕓豆等，按豆莖的生長(zhǎng)習(xí)性可分為矮生菜豆和蔓生菜豆[1]，矮生菜豆相比于蔓生菜豆具有生育期、收獲期短，種植成本低，便于生產(chǎn)管理等優(yōu)點(diǎn)，但也存在產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)效益低，不耐澇等缺點(diǎn)。然而有關(guān)蔓生與矮生菜豆對(duì)比的研究較少，且多數(shù)關(guān)于株型、株高、產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀，而少有對(duì)菜豆生理特性的報(bào)道。

光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，隨著植株發(fā)育呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)水平，其作用強(qiáng)弱決定植株長(zhǎng)勢(shì)與效益[2]，不同植株不同時(shí)期之間存在較大差異花芽分化期[3]。和花期是植物發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)植株由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)，逐漸形成生殖器官，即從葉芽的生理組織狀態(tài)轉(zhuǎn)化為花芽的生理組織狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)育成花器官原基雛形的過(guò)程[4-5]。這是一個(gè)形態(tài)和生理生化建成的過(guò)程，分化的好壞又直接影響開(kāi)花率及果實(shí)的產(chǎn)量。

前人大多以單一菜豆品種或性狀展開(kāi)花芽形態(tài)、生理測(cè)定等研究，少有對(duì)矮生和蔓生對(duì)比分析，筆者選取矮生和蔓生2個(gè)菜豆品種，探究?jī)烧呋ㄑ糠只男螒B(tài)差異及分化過(guò)程中植物光合速率等生理指標(biāo)的變化，以期探討不同生長(zhǎng)類(lèi)型菜豆發(fā)育特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試材料來(lái)自黑龍江大學(xué)園藝學(xué)課題組，分別挑選120粒飽滿(mǎn)的‘將軍’和‘熱那亞’菜豆種子于2020年7月在黑龍江大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行播種，壟距60 cm，穴距30 cm，每壟10穴，分4壟，每穴播種3粒，出苗后每穴保苗2株，正常大田管理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀測(cè)定 初生真葉完全展開(kāi)至葉腋或頂端開(kāi)始出現(xiàn)凸起的生長(zhǎng)錐之前，視為菜豆苗期；葉腋或頂端開(kāi)始出現(xiàn)凸起的生長(zhǎng)錐至開(kāi)花前，視為開(kāi)始花芽分化期；菜豆從產(chǎn)生旗瓣、翼瓣展平的開(kāi)放花苞至不再開(kāi)花視為花期。所有種植材料中，超過(guò)50%菜豆達(dá)到上述生長(zhǎng)狀態(tài)即認(rèn)為到達(dá)該發(fā)育時(shí)期，以此記錄菜豆各生長(zhǎng)發(fā)育階段開(kāi)始及持續(xù)的時(shí)間。

測(cè)定出苗后15、30、45、60天植株干、鮮重，計(jì)算絕對(duì)生長(zhǎng)速率，如式(1)，每次隨機(jī)選取3株作為生物重復(fù)，測(cè)定各項(xiàng)農(nóng)藝指標(biāo)并計(jì)算均值。

式中，W1為前期鮮重，W2為后期鮮重，T1為前期時(shí)間，T2為后期時(shí)間。

1.2.2 花芽石蠟切片 在熱那亞花芽分化初期（播種后15天）和將軍花芽分化初期（播種后18天），一次性采摘分化初始期、花序原基分化期、萼片分化期、雌雄蕊原基分化期、花瓣原基分化期、雌雄蕊原基分化后期、花器官完成期的‘熱那亞’和‘將軍’飽滿(mǎn)無(wú)病害花芽，并用FAA固定液固定[6]，采用常規(guī)石蠟切片法，即材料的固定→軟化→各級(jí)濃度的乙醇溶液脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→展片→脫蠟→番紅染色→固綠染色→脫水→透明，用加拿大中性樹(shù)膠封片，制成永久切片。用萊卡DM4000 B LED正置顯微鏡觀察、拍照。

1.2.3 光合速率測(cè)定 選‘將軍’和‘熱那亞’葉片（苗期取倒數(shù)第3片三出復(fù)葉，花期‘熱那亞’和‘將軍’分別取倒數(shù)第5節(jié)和第8節(jié)三出復(fù)葉）進(jìn)行掛牌標(biāo)記，于9:30—11:00利用美國(guó)思愛(ài)迪(CID)CI-340便攜式光合作用測(cè)定儀，測(cè)定出苗后15、20、30、35、40、45、50、55、60、65天葉片的光合指標(biāo)[光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)][7]，每個(gè)葉片重復(fù)3次，共測(cè)5片。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 選‘將軍’和‘熱那亞’葉片（苗期取倒數(shù)第3片三出復(fù)葉，花期‘熱那亞’和‘將軍’分別選取倒數(shù)第5節(jié)和第8節(jié)三出復(fù)葉）進(jìn)行掛牌標(biāo)記，取出苗后15、20、30、35、40、45、50、55、60、65天葉片，剪碎混勻后稱(chēng)0.5 g用錫紙包好置于液氮中速凍，每個(gè)樣品重復(fù)3次，用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[8]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所有測(cè)定指標(biāo)均取3次重復(fù)的平均值，繪圖采用Excel完成，差異顯著性采用DPS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆絕對(duì)生長(zhǎng)速率

苗期（0～15天）‘熱那亞’絕對(duì)生長(zhǎng)速率是‘將軍’的2.14倍，之后進(jìn)入生殖生長(zhǎng)，‘將軍’絕對(duì)生長(zhǎng)速率急增超過(guò)‘熱那亞’，2個(gè)品種的絕對(duì)生長(zhǎng)速率均在花期達(dá)到最大值，‘將軍’花期（45～60天）為‘熱那亞’花期（31～45天）的2.12倍（圖1）。

圖1 菜豆絕對(duì)生長(zhǎng)速率

2.2 菜豆苗期、分化期及花期各階段持續(xù)時(shí)間

菜豆于7月17日播種，7月20日破土，7月25日出苗完成。‘熱那亞’8月5日開(kāi)始花芽分化，8月16日進(jìn)入花期，8月26日花期結(jié)束；‘將軍’8月8日開(kāi)始花芽分化、9月1日進(jìn)入花期（表1）。由此可見(jiàn)，矮生菜豆進(jìn)入花芽分化時(shí)期和開(kāi)花期均早于蔓生菜豆。

表1 菜豆花期前各階段持續(xù)時(shí)間

2.3 菜豆花芽分化的過(guò)程及特征

菜豆花芽分化是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程。為了便于記載和描述，根據(jù)花器官的分化順序分為7個(gè)時(shí)期，分別是分化初始期、花序原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雌雄蕊原基分化期、雌雄蕊原基分化后期、花器官完成期[9-10]。

分化初始期作為花芽分化的起始時(shí)期，出現(xiàn)在出苗后10天左右，‘熱那亞’從頂端依次向下產(chǎn)生花芽，‘將軍’從中部葉腋分別向上下產(chǎn)生花芽，且‘將軍’的分化初始期出現(xiàn)較‘熱那亞’晚3天左右（圖2R1、D1）。

花序原基分化期花芽的生長(zhǎng)錐快速發(fā)育變成扁平狀，并分化成序軸節(jié)，節(jié)上生長(zhǎng)出片狀的序節(jié)苞片（圖2R2、D2）。

萼片分化期花序原基體積不斷增大。首先在其頂部相對(duì)的兩側(cè)分化產(chǎn)生1對(duì)小花苞片內(nèi)苞，其葉平面又與分枝苞外苞的葉平面垂直。小花苞片一出現(xiàn)，花原基頂端很快出現(xiàn)一圈不連續(xù)的堰狀突起即花萼原始體（圖2R3、D3）。

雌雄蕊原基分化期花萼半包小花，長(zhǎng)度占小花的2/3，頂端有一小孔。這個(gè)時(shí)期花萼原基向上隆起長(zhǎng)大，在原基頂端周?chē)霈F(xiàn)圍成一周的幾個(gè)小珠狀突起，中央處還有一個(gè)較高一些的乳狀突起，這就是雄蕊和雌蕊原基，它們都被已迅速伸長(zhǎng)并向心包合的幼小花萼包裹著。此時(shí)已有明顯的分枝（圖2R4、D4）。

花瓣原基分化期雄蕊原基外側(cè)出現(xiàn)花瓣原基，心皮縫對(duì)應(yīng)的近軸花瓣原基（旗瓣原基）分化不明顯（圖2R5、D5）。

雌雄蕊原基分化后期花萼將小花緊緊包住，頂端呈圓錐形，內(nèi)部隨著花冠原基出現(xiàn)后不久，第一輪外輪雄蕊的花萼分化出來(lái)，而后是第二輪內(nèi)輪雄蕊的花藥出現(xiàn)?；ò曛衅彀臧l(fā)育最快并抱合其他花瓣，抱合前雌蕊子房腔內(nèi)，已有了胚珠突起，整個(gè)雄蕊群中花藥、花絲己能明顯區(qū)別開(kāi)來(lái)，花藥內(nèi)已出現(xiàn)花粉母細(xì)胞（圖2R6、D6）。

產(chǎn)生大小孢子后，花器進(jìn)入增長(zhǎng)高峰期，花器明顯肥大起來(lái)，進(jìn)入花器官完成期。高速伸長(zhǎng)的花冠自花萼伸出，在此階段生長(zhǎng)并達(dá)到定長(zhǎng)。花瓣、萼片等覆蓋物逐漸伸長(zhǎng)，把生殖器官覆蓋，形成蕾（圖2R7、D7）。

圖2 花芽分化進(jìn)程圖

2.4 蛋白質(zhì)含量

‘熱那亞’花芽分化發(fā)育期為8月5—15日，花期為8月16—25日‘；將軍’花芽分化發(fā)育期為8月10—31日，花期為9月1—20日。為方便對(duì)比2個(gè)菜豆不同時(shí)期各指標(biāo)的差異，所以用各時(shí)期的中間值進(jìn)行對(duì)比，即‘熱那亞’花芽分化期（8月10日）與‘將軍’花芽分化（8月20日）相比‘，熱那亞’花期（8月20日）與‘將軍’花期（9月10日）相比。

‘熱那亞’花芽分化期蛋白質(zhì)含量顯著高于‘將軍’，但花期‘熱那亞’顯著低于‘將軍’（圖3）。‘熱那亞’分化期先升高后下降，到花期中期（8月20日）達(dá)到最低值，之后又上升；‘將軍’在同樣時(shí)間段與‘熱那亞’表現(xiàn)出相同規(guī)律，但‘熱那亞’在發(fā)育后期蛋白質(zhì)含量驟降（圖4）。

圖3 各時(shí)期葉片蛋白質(zhì)含量

圖4 各時(shí)間點(diǎn)葉片蛋白質(zhì)含量

2.5 光合速率

‘熱那亞’花芽分化期凈光合速率呈上升趨勢(shì)且顯著高于‘將軍’，其花期呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且兩者花期光合速率無(wú)顯著差異（圖5）。

圖5 各時(shí)期葉片凈光合速率

‘熱那亞’花芽分化期蒸騰速率呈上升趨勢(shì)，花期下降，各時(shí)期騰速率顯著高于‘將軍’；而‘將軍’分化期呈下降趨勢(shì)，花期呈現(xiàn)2個(gè)波峰，在開(kāi)花前期（9月5日）和開(kāi)花后期（9月15日）達(dá)到2個(gè)峰值（圖6）。

圖6 各時(shí)期葉片蒸騰速率

‘熱那亞’花芽分化期氣孔導(dǎo)度與‘將軍’無(wú)明顯差異，花期顯著高于‘將軍’?！疅崮莵啞只谏仙?，花期下降；‘將軍’分化期呈下降趨勢(shì)，花期呈2個(gè)波峰，在開(kāi)花前期（9月5日）和開(kāi)花后期（9月15日）達(dá)到2個(gè)峰值（圖7）。

圖7 各時(shí)期葉片氣孔導(dǎo)度

‘熱那亞’花芽分化期胞間二氧化碳濃度顯著高于‘將軍’（圖8），花期無(wú)明顯差異，且‘熱那亞’花期結(jié)束（8月30日）前葉片胞間二氧化碳濃度先降低后升高，花期開(kāi)始時(shí)（8月15日）達(dá)到峰值；‘將軍’表現(xiàn)出相同規(guī)律，但最低值出現(xiàn)在花期中期（9月10日）。

圖8 各時(shí)期葉片胞間二氧化碳濃度

3 結(jié)論與討論

矮生菜豆出苗期在播種后8～9天[11]，初花期在播種后35～40天[12]，時(shí)間略長(zhǎng)于本研究結(jié)果，但劉庭付等[13]在浙江地區(qū)5月20日播種的蔓生菜豆與本實(shí)驗(yàn)中‘將軍’的始花期均在播種后45天開(kāi)花。推測(cè)可能是本實(shí)驗(yàn)種植在7月中旬，高溫促進(jìn)了植株生長(zhǎng)發(fā)育?！畬④姟只捌诨ㄑ糠只俣容^慢，開(kāi)始分化10天后速率升高；花期持續(xù)時(shí)間20天，是‘熱那亞’的2倍，‘將軍’開(kāi)花較為分散且花期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，‘熱那亞’開(kāi)花集中且花期持續(xù)時(shí)間短。形成蔓生菜豆采摘期持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，矮生菜豆統(tǒng)一收獲且節(jié)省成本等特點(diǎn)。對(duì)2個(gè)不同品種菜豆花芽的分化初始期、花序原基分化期、萼片原基分化期、雌雄蕊原基分化期、花瓣原基分化期、雌雄蕊原基分化后期、花器官完成期7個(gè)時(shí)期[6]的花芽制作石蠟切片發(fā)現(xiàn)，‘熱那亞’和‘將軍’的花芽分化過(guò)程、形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異。但兩者開(kāi)始分化的時(shí)間相差2～3天，且‘熱那亞’在開(kāi)始分化后即進(jìn)入快速的花芽分化期，而‘將軍’在‘熱那亞’進(jìn)入花芽分化期2～3天后只出現(xiàn)少量分化的花芽，直到開(kāi)始分化后15天才逐漸產(chǎn)生較多花芽。

在菜心[14]、杜鵑花[15]、西紅柿[16]、芒果[17]、棗花[18]等作物中均發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)植物花芽分化發(fā)揮著重要作用。楊春民[19]和王利琳[20]發(fā)現(xiàn)黃瓜子葉培養(yǎng)物花芽分化初期，可溶性蛋白含量呈下降趨勢(shì)；而本實(shí)驗(yàn)中，‘熱那亞’花芽分化期蛋白質(zhì)含量顯著高于‘將軍’，推測(cè)是因?yàn)椤疅崮莵啞只跁r(shí)間短，為完成花芽分化、形成花苞而積累大量蛋白質(zhì)?！畬④姟汀疅崮莵啞_(kāi)始分化后，蛋白質(zhì)含量顯著上升，到開(kāi)花前達(dá)到峰值[21-22]，開(kāi)花后驟降，并在開(kāi)花后期有所回升。推測(cè)是開(kāi)花初期植株蛋白質(zhì)消耗大，且蛋白質(zhì)的合成和消耗高峰期會(huì)集中在特定時(shí)期。

本實(shí)驗(yàn)中‘將軍’伸蔓期（8月10—30日）凈光合速率顯著高于苗期（8月5日），其伸蔓期主要以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主，凈光合速率相較苗期有所增加[23-24]，但‘將軍’的凈光合速率低于‘熱那亞’；同時(shí)發(fā)現(xiàn)始花期是植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的過(guò)渡期，凈光合速率有所降低，這與‘將軍’的花期凈光合速率規(guī)律一致，但‘熱那亞’在花期并沒(méi)有表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，而是穩(wěn)定維持在較高水平。

‘將軍’和‘熱那亞’胞間二氧化碳濃度在測(cè)定的前期（8月10日）和后期（9月20日）較高，符合苗期植株生長(zhǎng)對(duì)CO2的需求較小，光合能力弱；后期溫度較低、光照輻射較弱，導(dǎo)致胞間CO2濃度較高。劉麗娜等[25]發(fā)現(xiàn)，隨著生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，氣溫不斷升高，光照強(qiáng)度增加，光合能力增強(qiáng)，對(duì)水分需求增加，胞間CO2濃度呈降低趨勢(shì)，與本研究結(jié)果一致。同時(shí)‘熱那亞’在花芽分化期的凈光合速率與胞間二氧化碳濃度均顯著高于‘將軍’，與翟錫姣等[16]發(fā)現(xiàn)的光合速率與胞間二氧化碳濃度呈正比的結(jié)果一致。

‘將軍’、‘熱那亞’的氣孔導(dǎo)度與蒸騰速率呈正相關(guān)，因?yàn)闅饪讓?dǎo)度降低引起水分由葉片向外排放的阻力增大，導(dǎo)致蒸騰速率降低。本研究中，‘熱那亞’在花期的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率顯著高于‘將軍’，在其他菜豆[26]和山楂[27]的研究中也同樣發(fā)現(xiàn)矮生植株下表皮的氣孔數(shù)大于蔓生品種。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了矮生菜豆‘熱那亞’與蔓生菜豆‘將軍’花芽分化結(jié)構(gòu)與時(shí)間、發(fā)育時(shí)期、生理特性等方面的特點(diǎn)，簡(jiǎn)單揭示了蔓生與矮生菜豆之間生長(zhǎng)發(fā)育、生理特性的異同點(diǎn)，為進(jìn)一步研究矮生于蔓生菜豆品種發(fā)展間套作種植模式，改善蔬菜田間配置，實(shí)施高產(chǎn)栽培技術(shù)提供了理論依據(jù)和支持。在本研究中，由于矮生菜豆與蔓生菜豆生長(zhǎng)高度的差異，光合測(cè)定及生理指標(biāo)測(cè)定時(shí)僅選擇一個(gè)節(jié)位的葉片，不能夠全面對(duì)比兩者的差異，建議后續(xù)試驗(yàn)每次取樣時(shí)，按植株高度合理選取多個(gè)節(jié)位樣品進(jìn)行測(cè)定。本研究?jī)H從生理角度對(duì)不同生長(zhǎng)習(xí)性菜豆進(jìn)行分析，接下來(lái)可以從分子角度，利用高通量測(cè)序技術(shù)，挖掘不同生長(zhǎng)習(xí)性菜豆的差異基因。