蒙麗斌， 潘洪平

痔瘺洗液由紅花、山銀花、大黃、桃仁、花椒、當歸、苦參、虎杖、黃柏、地榆炭、白芷和芒硝(配比為2∶3∶3∶1.5∶1.5∶2∶3∶3∶3∶3∶3∶1.5)共十二味中藥經加工制成[1]，處方中的大黃具有利濕退黃、瀉熱通便、解毒消癰之功，為駿猛之品當為君藥，與臣藥黃柏、山銀花、苦參、地榆炭、白芷(輔助君藥大黃加強清熱解毒、活血止痛、收斂生肌之功)，佐藥紅花、桃仁、花椒、當歸、虎杖(協(xié)助君、臣藥以加強治療作用)，使藥芒硝(引經調和藥)，共奏清熱解毒、活血止痛、收斂生肌之功效。藥理研究表明，痔瘺洗液對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、甲型鏈球菌、乙型鏈球菌等細菌均有抑制作用[2]。本品臨床主要用于痔瘡術后坐浴[3]、痔瘺病[4]和肛門水腫[5]等治療。由于大黃素和大黃酚為痔瘺洗液的重要抗菌活性成分，因此，測定大黃素和大黃酚的含量對痔瘺洗液的質量控制顯得尤為重要。根據(jù)大黃素和大黃酚的分子結構特點，本研究采用高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)法同時測定痔瘺洗液中大黃素和大黃酚的含量，為建立該制劑的質量控制方法和質量評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；CP225D型電子天平(德國賽多利斯公司)；AW-120型電子天平(西班牙COBOS公司)。大黃素、大黃酚對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110756-200110、110796-200615。規(guī)格：大黃素含量為98.7%，20 mg/支；大黃酚含量為99.2%，20 mg/支)。痔瘺洗液(上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，批號：20101214、20100711、20100121，均在藥品有效期內完成試驗)。乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為超純水。

1.2方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。柱溫25 ℃。進樣量：供試品、對照品各10 μl。流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20，V/V)。檢測波長選擇254 nm。流速為0.8 ml/min。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取大黃素、大黃酚對照品適量，加入無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液制成每1 ml含大黃素10 μg、大黃酚25 μg的混合對照品溶液，作為對照品儲備液。

1.2.2.2 供試品溶液的配制 精密量取供試品30 ml，加鹽酸3 ml，加熱回流30 min，立即冷卻，用三氯甲烷提取3次，每次30 ml合并三氯甲烷液，蒸干，殘渣用甲醇使溶解，轉移至10 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，制得供試品溶液。該法制備的供試品溶液所得的峰形、出峰時間及分離都可達到較好效果。

1.2.2.3 陰性樣品溶液配制 取不含大黃的陰性樣品，采用供試品溶液制備方法(“1.2.2.2”項下)制備陰性樣品溶液，進樣分析。

1.2.2.4 線性關系考察 分別取“1.2.2.1”項下的大黃素和大黃酚對照品溶液，加甲醇制成每1 μl含大黃素0.16 μg、大黃酚0.79 μg的混合對照品溶液，作為系列濃度的對照品溶液。依次自動進樣5、10、15、20、25 μl，記錄色譜圖。以對照品進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸分析。

1.2.2.5 精密度考察 分別精密吸取“1.2.2.1”項下的大黃素和大黃酚混合對照品溶液10 μl，在相同的色譜條件下連續(xù)進樣6次，分別測定峰面積的積分值。分別計算大黃素、大黃酚峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于室溫下0、2、4、6、8、12、24 h分別按上述色譜條件測定，分別測定大黃素、大黃酚的峰面積積分值，分別計算大黃素、大黃酚峰面積的RSD。

1.2.2.7 重復性試驗 取同一批樣品(批號：20100711)共6份，按供試品溶液制備方法平行制備溶液并測定大黃素、大黃酚的平均含量及其相應的RSD。

1.2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品(批號：20100711)10 ml，分別精密加入一定量的大黃素、大黃酚對照品，按“1.2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項下的色譜條件測定，計算加樣回收率。

1.2.2.9 樣品含量測定 取3批痔瘺洗液樣品，按“1.2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項下的色譜條件測定，計算樣品的大黃素、大黃酚含量。

2 結果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗結果 結果表明，大黃素和大黃酚，及其與雜質峰分離良好，分離度>1.5，所得峰形尖，對稱，重復性好，無拖尾現(xiàn)象，理論塔板數(shù)符合要求，說明色譜柱柱效高，同時無陰性干擾，出峰時間亦達到滿意的效果。結果提示色譜條件選擇恰當，系統(tǒng)適用性試驗良好。見圖1。

?對照品；?供試品；?陰性樣品(15.728-大黃素；21.171-大黃酚)

2.2線性關系考察結果 以對照品進樣量X(μg)(為橫坐標)，對峰面積Y(為縱坐標)進行線性回歸分析，結果表明，各組分在表1濃度范圍內的線性關系良好。見表1。

表1 大黃素和大黃酚的線性與范圍

2.3精密度考察結果 大黃素、大黃酚峰面積的RSD分別為0.35%、0.12%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗結果 室溫下0～24 h內，大黃素、大黃酚的RSD分別為1.52%、0.44%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內基本穩(wěn)定。

2.5重復性試驗結果 同一批樣品的大黃素、大黃酚的平均含量分別為4.83 μg/ml、9.29 μg/ml，RSD分別為0.84%、0.61%(n=6)，表明分析方法重復性良好。

2.6加樣回收率試驗結果 已知含量的樣品的加樣回收率試驗結果提示，大黃素、大黃酚的平均回收率分別為98.80%、102.50%，RSD分別為0.19%、0.02%。見表2。

表2 加樣回收率試驗測定結果

2.7樣品含量測定結果 3批痔瘺洗液樣品的大黃素、大黃酚含量測定結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1大黃素與大黃酚具有相似的分子結構，兩者極性相近，傳統(tǒng)的化學分析方法可將大黃素與大黃酚混合物(如總蒽醌)的乙醚液，依次用碳酸鈉、氫氧化鈉水溶液萃取，分別得到大黃素、大黃酚；或利用聚酰胺柱層析法，以稀醇至高濃度醇洗脫，依次得到大黃素、大黃酚。但這些方法具有步驟繁瑣、操作復雜、準確度差、回收率低、精密度和重復性不高、分析結果慢等缺點，均不適宜作為制劑的質量控制方法。HPLC法以液體為流動相，將不同極性的混合物溶于溶劑中，通過高壓輸液系統(tǒng)，泵入裝有固定相的色譜柱中，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測。HPLC法具有高壓、高速(分析速度快)、高效(分離效能高)、高靈敏度、操作簡便、重現(xiàn)性好和應用范圍廣等特點。已有一些文獻報道通過HPLC法同時測定大黃素、大黃酚等成分的含量，對口服中成藥[6-7]、外用中成藥[8-11]、中藥材[12-13]甚至一些民族藥[14]進行有效質量控制。由于大黃是痔瘺洗液的重要藥味，而大黃素和大黃酚則是大黃的主要有效成分。目前已見一些關于痔瘺洗液質量標準研究的報道：楊家福等[15]采用薄層色譜法鑒別痔瘺洗液中的大黃、黃柏；陳展[16]采用加速試驗和長期試驗方法,考察痔瘺洗液在不同試驗條件下樣品的性狀、鑒別、含量及微生物的變化,并對痔瘺洗液進行了質量穩(wěn)定性考察,以評價該藥品質量；陳展和凌曉云[17]還建立了痔瘺洗液微生物限度檢查方法；陳展和吳曉燕[18]采用HPLC法對山銀花中的綠原酸進行了含量測定以建立痔瘺洗液的質量控制方法。本研究采用HPLC法同時測定痔瘺洗液中主要抗菌活性成分大黃素和大黃酚的含量，具備一定的難度和較好的藥理針對性，其方法及實驗過程可重復性較好，進一步拓寬痔瘺洗液的質量標準研究，為建立該制劑精準的質量控制方法和提高質量評價標準提供依據(jù)，具備一定的創(chuàng)新性和指導意義。

3.2從本研究結果概括出以下幾點體會。(1)大黃素、大黃酚提取條件的確定。在對痔瘺洗液中大黃素和大黃酚進行提取的預實驗中，曾試用5%～30%鹽酸進行酸化處理，結果表明利用10%鹽酸酸化后提取效果最佳。在對加熱回流時間(5～60 min)進行考察時確定加熱回流30 min為最佳時間。在對甲醇、乙醇、三氯甲烷等溶劑進行考察時，確定三氯甲烷提取3次較為完全且易于揮發(fā)蒸干溶劑。(2)大黃素、大黃酚檢測波長的確定。根據(jù)大黃素和大黃酚均具有共軛雙鍵結構的特點，以及凡具有芳香環(huán)或共軛雙鍵結構的有機化合物在特定吸收波長處所測得的吸收度可用于藥品的鑒別、純度檢查及含量測定的原理[19]，各取大黃素、大黃酚對照品的甲醇溶液，經可見紫外分光光度計，在220～470 nm波長的范圍內進行掃描，結果大黃素和大黃酚的最大吸收波長分別是253.9 nm和255.1 nm。借鑒其他含大黃成分的中成藥進行大黃素和大黃酚含量同時測定以監(jiān)控產品質量的方法[20]，以及筆者對含大黃成分的中成藥痔瘺洗液樣品的實際測定結果，本研究確定大黃素、大黃酚同時測定的檢測波長為254 nm。(3)流動相和柱溫的確定。一般用于分離大黃素和大黃酚的流動相主要有甲醇-0.1%磷酸水溶液(70∶30)、甲醇-0.1%磷酸水溶液(85∶15)和甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)。對以上的流動相，采用柱溫25℃，流速0.8 ml/min，逐一系統(tǒng)進行試驗，結果發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)為流動相時，對痔瘺洗液中大黃素、大黃酚及其相鄰峰分離良好，分離度>1.5，同時所得到的峰形尖，對稱，重復性好，不拖尾，理論塔板數(shù)符合要求，柱效高，同時無陰性干擾，出峰時間亦達到滿意的效果。(4)進樣量的考察。分別對進樣量為5 μl、10 μl、20 μl的對照品和樣品進行考察，結果發(fā)現(xiàn)，在峰的響應值滿足的前提下，綜合考慮峰形、峰高、RSD值、雜質干擾和色譜柱壽命等情況，決定10 μl為較為理想的進樣量。(5)色譜條件的確定。通過優(yōu)選，本研究確定HPLC法同時測定痔瘺洗液中大黃素和大黃酚含量的色譜條件：柱溫25 ℃，流速0.8 ml/min，流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(80∶20)。

總之，利用上述色譜條件以HPLC法同時測定痔瘺洗液中的大黃素、大黃酚含量時，大黃素、大黃酚與其他干擾成分得到較好的分離。該法具有操作簡單、準確、回收率好、精密度和重復性高、分析快速等優(yōu)點，可用來連續(xù)測定痔瘺洗液中的大黃素、大黃酚含量，同時該色譜條件下陰性樣品溶液不產生干擾，提示該方法適合作為痔瘺洗液的質量控制方法。