朱明君，陸曉媛,方月蘭

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇宿遷 223800；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇徐州 221004)

宮頸癌是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。降低宮頸癌病死率、改善預(yù)后是臨床婦科工作重點(diǎn)。盡管已經(jīng)提出了多種與宮頸癌進(jìn)展有關(guān)的病理學(xué)機(jī)制，但仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)揭示宮頸癌的發(fā)生機(jī)制[2]。據(jù)報(bào)道，組氨酸磷酸酶(LHPP)是一種腫瘤抑制因子[3]。組氨酸磷酸化在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，目前LHPP表達(dá)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用成為研究熱點(diǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)人宮頸癌組織中的LHPP表達(dá)水平低于正常組織標(biāo)本[4]，但LHPP表達(dá)與宮頸癌預(yù)后及臨床特征間關(guān)系報(bào)道較少。本研究探討LHPP蛋白在宮頸癌中表達(dá)情況，以及其臨床意義及對(duì)患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1月至2014年12月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院存檔的石蠟組織標(biāo)本，包括90例宮頸癌標(biāo)本(A組)，90例宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變標(biāo)本(B組，其中低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變40例，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變50例)和90例慢性宮頸炎標(biāo)本(C組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均存在明確的病理診斷，均由兩名以上經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行閱片確診；(2)宮頸癌病例按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2018年的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，組織病理分級(jí)按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分級(jí)方法評(píng)定為ⅠA～ⅡA期[5]，所收集的宮頸癌標(biāo)本患者術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療或免疫治療，宮頸癌患者均可獲得術(shù)后隨訪資料；(3)宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變患者標(biāo)本來(lái)自電子陰道鏡下多點(diǎn)活檢標(biāo)本和(或)宮頸錐切術(shù)后標(biāo)本或全子宮切除標(biāo)本；(4)慢性宮頸炎組織標(biāo)本均來(lái)自同期因子宮肌瘤或其他非宮頸性病變行子宮全切術(shù)的病例；(5)患者未合并其他腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)來(lái)源于其他腫瘤的轉(zhuǎn)移癌；(2)術(shù)前進(jìn)行化療、放療或藥物治療；(3)合并免疫系統(tǒng)疾病。本研究取得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本采集取得患者本人或家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1主要試劑及儀器

兔抗人LHPP抗體(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab254788-100 μL)，即用型高效免疫組織化學(xué)二抗試劑盒(上海愛(ài)必信生物科技有限公司，貨號(hào)abs957-5 mL)，石蠟組織切片機(jī)(Leica RM2015)，病理組織漂烘儀(PHY-Ⅲ)，電熱恒溫干燥箱(GZX-DH-400-BS)。

1.2.2LHPP檢測(cè)方法

采用免疫組織化學(xué)第二代聚合酶標(biāo)兩步法(PV法)檢測(cè)LHPP在各宮頸組織中表達(dá)水平[3]。具體步驟：石蠟包埋的宮頸組織常規(guī)切片；切片烘干、脫蠟、水化；檸檬酸鈉緩沖液中高壓修復(fù)抗原15 min；加入過(guò)氧化氫孵育10 min；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗2～3次各5 min；加入超級(jí)封閉液孵育5 min以減少非特異性染色；加一抗，室溫孵育20 min；PBS洗2～3次各5 min；加入一抗放大劑孵育10 min；PBS洗2～3次各5 min；加入酶標(biāo)二抗聚合物孵育10 min；PBS洗2～3次各5 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；常規(guī)脫水，透明，封片，閱片。

1.2.3免疫組織化學(xué)結(jié)果評(píng)定

(1)免疫組織化學(xué)結(jié)果請(qǐng)病理科主任醫(yī)師雙盲法閱片。免疫組織化學(xué)陽(yáng)性表達(dá)為境界清晰，突出于背景的中黃或棕褐色顆粒，存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)為陽(yáng)性細(xì)胞。(2)免疫組織化學(xué)判讀方法[3]：①根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無(wú)色，1分為淺黃色，2分為中黃色，3分為棕黃色；②根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例：<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，≥75%為4分；③兩種積分相乘總分：≤3分為陰性，>3分為陽(yáng)性。

1.2.4治療方法

所有患者均接受腹腔鏡手術(shù)，同步放化療：術(shù)后放療2 Gy/次，共40～60 Gy，共20～23次，順鉑40 mg/m2，每周1次，共4～5次。化療：紫杉醇135～175 mg/m2加順鉑75 mg/m2，每周3次，共4個(gè)療程。本研究中共19例術(shù)后接受單純輔助化療，71例接受同步放化療。

1.2.5隨訪方法

手術(shù)時(shí)間為隨訪開(kāi)始時(shí)間，隨訪截至2020年1月?？傮w生存(overall survival，OS)期定義為隨訪開(kāi)始時(shí)間至隨訪截止時(shí)間或死亡時(shí)間。通過(guò)電話隨訪，每半年進(jìn)行1次隨訪，隨訪終點(diǎn)為宮頸癌相關(guān)死亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)分析，用Kaplan-Meier法和Log-rank法行生存分析并繪制生存曲線，使用單、多因素Cox分析進(jìn)行預(yù)后分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié) 果

2.1 不同宮頸標(biāo)本LHPP表達(dá)情況

A組25例(27.8%)LHPP表達(dá)陽(yáng)性，B組41例(45.6%)LHPP表達(dá)陽(yáng)性，其中低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變24例(26.7%)LHPP表達(dá)陽(yáng)性，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變17例(18.9%)LHPP表達(dá)陽(yáng)性，C組69例(76.7%)LHPP表達(dá)陽(yáng)性，3組LHPP表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=44.089，P<0.001)。高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變LHPP表達(dá)陽(yáng)性率低于低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(χ2=6.057，P=0.014)，見(jiàn)圖1。

A：宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變LHPP陽(yáng)性表達(dá)；B：慢性宮頸炎LHPP陽(yáng)性表達(dá)；C：宮頸癌組織LHPP陽(yáng)性表達(dá)；D：宮頸癌組織LHPP陰性表達(dá)。

2.2 不同LHPP表達(dá)情況比較

LHPP表達(dá)陽(yáng)性患者腫瘤分期ⅡA比例和淋巴血管侵犯率低于LHPP表達(dá)陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同LHPP表達(dá)情況比較[n(%)]

2.3 不同LHPP表達(dá)情況的宮頸癌生存曲線

隨訪時(shí)間48～75個(gè)月，平均(58.9±7.8)個(gè)月，共19例患者死亡，其中5年內(nèi)死亡14例，5年OS率為84.4%。Kaplan-Meier法并Log-rank檢驗(yàn)顯示，LHPP表達(dá)陽(yáng)性患者累積生存率高于LHPP表達(dá)陰性患者(Log-rankχ2=4.025，P=0.040)，見(jiàn)圖2。LHPP表達(dá)陽(yáng)性患者3年OS率為96.0%，高于對(duì)照組的78.2%(χ2=4.010，P=0.045)。

圖2 不同LHPP表達(dá)情況的宮頸癌患者生存曲線

2.4 宮頸癌OS的影響因素分析

Cox單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分期、淋巴血管侵犯、腫瘤等級(jí)、LHPP表達(dá)是宮頸癌患者OS的影響因素(P<0.05)。將年齡、腫瘤最大徑、腫瘤分期、淋巴血管侵犯、輔助化療、同步放化療、腫瘤等級(jí)、LHPP表達(dá)作為自變量，將OS作為因變量進(jìn)行Cox多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤分期、腫瘤等級(jí)、LHPP表達(dá)是宮頸癌患者OS的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見(jiàn)表2、3。

表2 宮頸癌OS的單因素分析

表3 宮頸癌OS的多因素分析

3 討 論

在癌癥中廣泛觀察到激酶或磷酸酶失調(diào)，如LHPP、蛋白激酶B(AKT)、蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)等。LHPP從蠕蟲(chóng)到人均具有28%的同一性，最初在豬的腦組織中被發(fā)現(xiàn)。最近，LHPP通過(guò)靶向作用于磷脂酰肌醇三激酶(PI3K)/AKT信號(hào)通路，被鑒定為肝細(xì)胞癌等多種腫瘤的抑癌基因[6]。它在肝癌標(biāo)本中低表達(dá)，其低表達(dá)與肝癌患者的不良生存相關(guān)[6]。在另一項(xiàng)研究中，LHPP在胰腺癌中下調(diào)，而LHPP沉默可促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展[7]。人胃腺癌組織中，LHPP表達(dá)也下調(diào)，且與胃癌的分化程度密切相關(guān)[8]。

LHPP在宮頸癌中的研究報(bào)道較少，ZHENG等[9]研究報(bào)道，LHPP在宮頸癌中低表達(dá)，下調(diào)的LHPP通過(guò)調(diào)節(jié)AKT，在宮頸癌中影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞凋亡。本研究觀察了LHPP蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，證實(shí)LHPP在宮頸癌組織中的表達(dá)下調(diào)，該結(jié)果與既往研究相符[9]。本研究顯示，隨著宮頸病變程度的加重，LHPP陽(yáng)性表達(dá)率隨之降低，說(shuō)明LHPP表達(dá)與宮頸病變程度密切相關(guān)，LHPP隨宮頸病變進(jìn)展表達(dá)遞減。在宮頸癌患者中，LHPP表達(dá)陽(yáng)性患者ⅡA期比例及淋巴血管侵犯率明顯低于LHPP表達(dá)陰性患者，提示LHPP表達(dá)下調(diào)可增加較高腫瘤分期及淋巴血管侵犯的風(fēng)險(xiǎn)。既往研究在其他腫瘤中觀察到LHPP表達(dá)下調(diào)增加腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，如胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等[7-8,10]。

本研究證實(shí)LHPP表達(dá)陽(yáng)性患者累積生存率高于LHPP表達(dá)陰性患者，且LHPP表達(dá)情況是宮頸癌患者OS的獨(dú)立影響因素，LHPP表達(dá)下調(diào)的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增高，預(yù)后更差，LHPP表達(dá)可能成為宮頸癌預(yù)后標(biāo)志物。

LHPP基因位于10號(hào)染色體，在人腦、腎、肝和膀胱組織中普遍表達(dá)，其與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，被認(rèn)為是抑癌基因[11-13]。目前，LHPP表達(dá)與宮頸癌進(jìn)展的關(guān)系仍不明確。多數(shù)研究支持LHPP陽(yáng)性表達(dá)抑制了腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，是宮頸癌的抑制因子，過(guò)表達(dá)減少了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。ZHENG等[9]研究顯示，過(guò)表達(dá)的LHPP通過(guò)促進(jìn)裂解的半胱氨酸蛋白酶-3和PARP誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡，LHPP可阻止宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并觸發(fā)細(xì)胞凋亡。且ZHENG等[9]在體內(nèi)通過(guò)抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)凋亡證實(shí)了LHPP的抗宮頸癌作用。PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路直接或間接參與癌癥發(fā)展，對(duì)該途徑任何成分的調(diào)節(jié)異常都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，細(xì)胞凋亡受到抑制，細(xì)胞代謝改變和腫瘤發(fā)生[14]。而LHPP在PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)中具有重要作用[15]。目前LHPP在宮頸癌中發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制尚不清楚，是否通過(guò)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用仍待體外研究證實(shí)。本研究患者5年OS率為84.4%，與余淼等[16]報(bào)道的ⅠB～ⅡA2期早期宮頸癌5年OS率(84.1%)相差不大。大樣本量調(diào)查顯示，Ⅰ～Ⅱ期早期宮頸癌5年疾病特異性O(shè)S率為73.7%～97.8%，5年OS率為40.6%～84.5%[17]。由于病例數(shù)不足，本研究的OS率符合既往研究。不同研究中OS率不同可能與病理選擇、治療、分化程度、淋巴血管侵犯、年齡等有關(guān)，本研究結(jié)論仍待大樣本量研究證實(shí)。

綜上所述，LHPP表達(dá)與宮頸癌預(yù)后及病理相關(guān)，隨著陽(yáng)性率降低，死亡風(fēng)險(xiǎn)及淋巴血管侵犯風(fēng)險(xiǎn)增高。