張秀麗 丁崗強(qiáng) 張守瑞

（1.?？h人民醫(yī)院感染疾病科，河南 浚縣 456250；2.河南省人民醫(yī)院感染性疾病科，河南 鄭州 450003；3.鶴壁市人民醫(yī)院腦卒中中心，河南 鶴壁 458030）

目前臨床上多采用患者肝纖維化程度來判斷患者乙型肝炎病情程度，但在乙型肝炎早期臨床上尚未出現(xiàn)肝纖維化，進(jìn)而缺少早期病情診斷方法。HBV 感染后，不同感染者臨床轉(zhuǎn)歸差異性大，多數(shù)感染者可以憑借自身免疫功能將體內(nèi) HBV清除，從而恢復(fù)健康。因此，免疫功能在患者臨床轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用[1]。

多種細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）是一種典型的促炎因子，可以參與Th1 細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時誘導(dǎo)多種炎性因子產(chǎn)生，進(jìn)而損傷肝細(xì)胞；干擾素誘導(dǎo)蛋白10（Interferon-inducible protein-10，IP-10）是一種趨化因子，研究顯示其在部分慢性HBV 感染患者中表達(dá)較高[2]。本文通過分析IL-12、IP-10 蛋白水平與慢性乙型肝炎病毒感染患者HBV DNA 載量的相關(guān)性，旨在尋找慢性乙型肝炎病情評估的特異性指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2018 年6 月至2020 年6 月期間收治的135 例慢性乙型病毒性肝炎感染患者，男 75例，女60 例；年齡18～60 歲，平均年齡46.78±8.44歲；體質(zhì)量指數(shù)20～25 kg·m-2，平均體質(zhì)量指數(shù)（24.15±0.67）kg·m-2。吸煙：79 例，總膽固醇4.43±1.07 mmol·L-1

納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；2 w 內(nèi)并未接受治療；經(jīng)患者及患者家屬同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他肝炎病毒感染；患有嚴(yán)重自身免疫性肝??；合并惡性腫瘤或肝腎良性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA 載量測定

于入組時采取患者外周血，以3000 rpm·min-1離心10 min 后，取血清標(biāo)本100 μL 經(jīng)蛋白酶K消化，70℃ 45 min、95℃ 10 min 裂解DNA 后進(jìn)行高速離心，取上清備檢。PCR 反應(yīng)總體積25 μL，包括反應(yīng)緩沖液2.5 μL、TaqDNA 酶（復(fù)旦大學(xué)遺傳所）1 μL、dNTP（華美生物工程公司）各0.2 mM、待檢樣品5 μL，剩余體積以無菌雙蒸水補(bǔ)足。分別以94℃、50℃、70℃循環(huán)35 周期。產(chǎn)物分析取10 μL PCR 產(chǎn)物在含0.5 μg·mL-1溴乙淀的2%瓊脂糖中電泳30 min，通過PCR 全自動分析儀對熒光進(jìn)行采集和定量分析。

根據(jù)HBV 基因保守序列設(shè)計引物（416 bp），上游引物：5'-CCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAG-3'（nt56-83）；下游引物：5'-AAGCCCCAACCAGTGGGGGTTGCGTCA-3'（nt1188-1214），由上海申友公司合成。

1.2.2 IP-10 及IL-12 水平測定

采集患者清晨空腹靜脈血5 mL，在低溫下經(jīng)3000 r·min-1離心15min 后分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IP-10 及IL-12 水平。

1.2.3 相關(guān)性分析

經(jīng)多元線性回歸分析不同HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

將所有數(shù)據(jù)采用SPSS26.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗；多元線性回歸分析HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間相關(guān)性。以P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫炎性因子水平

經(jīng)熒光定量PCR 法檢測135 例慢性乙型病毒性肝炎感染患者入組時 HBV DNA 載量（486.25±541.21）×105copy·mL-1；經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測IP-10 蛋白（106.69±29.70）pg·mL-1、IL-12（59.61±33.39）pg·mL-1。

2.2 HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間相關(guān)性

經(jīng)多元線性回歸分析后，IP-10 蛋白及IL-12水平均是慢性乙型肝炎病毒感染患者的影響因素，IP-10 蛋白及IL-12 水平均與HBV DNA 載量呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05），見表1 及圖1。

圖1 IP-10 蛋白及IL-12 水平與HBV 載量相關(guān)性回歸曲線P-P 圖

表1 HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間的多元線性回歸分析

3 討論

慢性乙型肝炎病毒感染在全世界范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率，給患者、家庭、社會帶來嚴(yán)重不良影響[4]。乙肝病毒進(jìn)入人體后，通過在體內(nèi)不斷復(fù)制，經(jīng)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞吞噬、加工遞進(jìn)而刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，進(jìn)而引發(fā)肝組織的免疫性病理損傷[5]。其中，約有50%左右的HBV 感染患者具有活躍的病毒復(fù)制和肝臟的慢性炎癥改變[6]。引發(fā)其慢性炎癥改變的原因，大概與以下幾個機(jī)制有關(guān)[7]：①在免疫、抗病毒治療壓力以及乙肝病毒自然復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)的乙肝病毒基因突變，逃逸出機(jī)體免疫系統(tǒng)的清除效應(yīng)；同時乙肝病毒的低復(fù)制能力尚不能將其有效清除；②HBVDNA 與肝細(xì)胞DNA 發(fā)生整合，引發(fā)肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄模板的建立，可以長期維持慢性乙肝病毒感染。同時乙肝病毒在免疫細(xì)胞中復(fù)制可以抑制免疫細(xì)胞活性，進(jìn)而長時間作用于患者機(jī)體清除能力，患者本身免疫力低下也是誘發(fā)慢性乙肝肝炎病毒感染的重要原因之一。慢性乙型肝炎病毒感染的持續(xù)性發(fā)展，會加重患者機(jī)體肝臟損傷程度，引發(fā)肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌的發(fā)生，進(jìn)而降低患者生存質(zhì)量，縮短生存時間。所以采取及時有效的治療對慢性乙型肝炎病毒感染患者具有重要意義。但是早期慢性乙型肝炎病毒感染患者臨床癥狀不明顯，故臨床開始探究不同免疫炎性因子對慢性乙型肝炎病毒感染患者的影響，以此來判斷其病情的發(fā)展。

干擾素誘導(dǎo)蛋白10屬于趨化因子CXC家族，可以通過激活機(jī)體免疫系統(tǒng)抵抗病毒抑制病毒復(fù)制。研究顯示，Th1 炎性反應(yīng)是HBV 干擾過程中發(fā)揮主要作用的免疫機(jī)制，而IP-10 是參與Th1炎性反應(yīng)的重要趨化因子，可以通過刺激淋巴細(xì)胞釋放炎性因子，并增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，促進(jìn)更多炎性因子返巢，同時炎性因子可以刺激IP-10 水平增加，進(jìn)一步促進(jìn)淋巴細(xì)胞聚集，最終參與機(jī)體肝細(xì)胞免疫應(yīng)答的過程，加重慢性乙型肝炎病毒感染的發(fā)展[8]。白細(xì)胞介素12 是是由抗原呈細(xì)胞以及B 細(xì)胞產(chǎn)生的，是一種異源二聚體形式的前炎癥細(xì)胞因子，可以刺激T 細(xì)胞的分化和增值，同時可以促進(jìn)對Th1 型細(xì)胞分化抑制，加重白細(xì)胞介素12 的調(diào)節(jié)紊亂，進(jìn)而引發(fā)慢性乙型肝炎病毒感染的發(fā)展[9]。

本研究中，HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平間的多元線性回歸分析顯示，IP-10 蛋白及IL-12 水平與慢性乙型肝炎病毒感染患者HBV DNA 載量呈正相關(guān)。

綜上所述，慢性乙型肝炎病毒感染患者HBV DNA 載量與IP-10 蛋白及IL-12 水平呈現(xiàn)正相關(guān)，可以作為臨床判斷慢性乙型肝炎病毒感染病情發(fā)展的診斷因素。本研究還存在納入病例少、時間短等局限性問題，還需后期大量實驗研究證明。